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细胞内DNA甲基化(5-mC)是随着细胞的生长、增殖不断变化着的,DNA甲基化的动态调控对细胞的正常生理功能起着重要作用.2009年研究者首次在哺乳动物神经细胞和胚胎干细胞中发现5-羟甲基胞嘧啶核苷(5-hmC),证实TET蛋白可以氧化5-mC为5-hmC.随后的深入研究进一步发现TET蛋白还可进一步催化5-hmC产生5-甲酰胞嘧啶(5-foC)和5-羧基胞嘧啶(5-caC),这些研究结果显示DNA去甲基化是通过TET催化的5-mC氧化和随后的脱羧作用而发生.由此,脊椎动物DNA中的5-hmC、5-foC、5-caC引起了人们极大地关注,被称为是DNA中除A、T、C、G、5-mC之后的第六个碱基、第七个碱基和第八个碱基.近几年研究发现5-hmC、5-foC、5-caC除了作为DNA去甲基化过程的中间产物,它们还可能为细胞分化和癌症研究提供重要信息.但是基因组中这些修饰核苷的含量很低,因此对它们的检测分析有一定的难度.在前期的研究工作中我们建立了online trapping-cHILIC-ESI-MS/MS高灵敏定量分析方法,对5-mC和5-hmC的检测限(LOD)分别达到0.06 fmol 与0.19 fmol [1]；通过利用糖基化标记法并结合质谱分析,建立了SPEHPLC-MS/MS方法用来检测哺乳动物和酵母细胞全基因组5-hmC,相比直接将DNA酶解液进HPLC-MS/M分析,灵敏度有50倍提高.利用该方法在酵母中发现5-mC和5-hmC [2,3]；建立了基于超高交联整体柱的全基因组5-mC的nanoLC分析方法,LOD比常规的HPLC-UV方法要低500倍[4].由于5-foC和5-caC的含量比5-mC和5-hmC低得多,因此检测分析难度也更大.最近我们通过发展衍生化试剂,衍生5-foC和5-caC之后再进行质谱分析(Figure 1)[5].由于衍生化试剂引入易电离基团,可以显著提高LC-MS对修饰碱基的检测灵敏度,实现对丰度极低的5-foC和5-caC的定量分析.我们的研究发现,在使用衍生化试剂衍生化之后,5-foC和5-caC的质谱响应可提高260倍和247倍.利用该方法,在多种物种中发现了5-foC和5-caC的修饰存在.