论文部分内容阅读
利迪链霉菌A01(Streptomyces lydicus A01)通过代谢产生纳他霉素拮抗番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)。纳他霉素是多烯烃大环内酯类抗生素,降解病原真菌的细胞膜。哈慈木霉菌(Trichoderma harzianum CECT2413)和深绿木霉菌(Trichoderma atroviride P1)通过代谢产生几丁质酶CHIT33和CHIT42抑制番茄灰霉菌。几丁质酶具有分解真菌细胞壁的作用。本试验通过接合转移技术将木霉菌的两个几丁质酶基因分别转化入利迪链霉菌A01中。工程菌株兼具产素和产酶的双重优势,可以协同分解病原真菌的细胞壁和细胞膜从而达到高抗的效果。本研究以番茄(佳粉19)和转木霉菌几丁质酶基因的链霉工程菌为供试材料,研究其诱导番茄抗灰霉病的机理。首先,采用PCR及RT-PCR技术鉴定成功构建A01-chit42和A01-chit33工程菌株;其次,采用几丁质粉为唯一碳源的基础培养基,DNS法检测几丁质酶活力;采用紫外分光光度法检测了外源基因对链霉菌纳他霉素产量的影响。结果证明几丁质酶的大量表达直接影响了纳他霉素的产量,与野生菌比较二者均提高了7倍,协同作用下拮抗番茄灰霉菌的能力也大大提高了。进一步通过光学显微镜观察到工程菌发酵液对灰霉菌的孢子萌发及菌丝体生长都有明显的影响,孢子萌发速率及菌丝体的生长速率明显缓慢,且菌丝体分支明显增多,密度也明显增大。将A01-chit33工程菌发酵液(约含纳他霉素40ug/ml;几丁质酶450U/ml)处理番茄叶片24h,出现了明显的过敏性坏死现象,DAB染色后证明番茄叶片爆发了ROS反应,我们推测发酵液中含有大量的激发活性氧爆发的物质,下一步工作需要鉴定工程菌发酵液中诱导番茄过敏性坏死的主要激发因子及过敏性坏死在抑制灰霉菌侵染中的生化基础,通过DGE、2D及RT-PCR等技术明确工程菌株发酵液及激发子诱导番茄抗病信号转导通路。最后用A01-chit33工程菌发酵液及灰霉菌同时、先后处理番茄幼苗,发酵液中的激发子类物质可以诱导番茄抗性,纳他霉素和几丁质酶可以协同拮抗灰霉菌,预计生防效果会有很大提高。