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大豆是全球重要的油料和蛋白作物。与蛋白质含量相比,大豆种子含油量遗传变异小,对其进行遗传改良的难度较大。深入解析大豆种子油脂生物合成及其调控分子机制可为大豆高油育种和油脂品质改良提供重要靶标。二酰甘油酰基转移酶(DGAT)可催化酰基-CoA链上的脂酰基转移到sn-1,2-二酰甘油(DAG)分子的sn-3碳原子上生成三酰甘油(TAG),被认为是TAG合成途径中的限速酶,也是控制种子油脂含量及其脂肪酸组成的关键酶。目前已发现3类序列和结构差异较大的DGAT蛋白家族,即DGAT1、DGAT2和DGAT3。大豆作为古四倍体物种,经历过全基因组加倍事件,绝大多数基因都存在2个或多个同源基因。尽管已有大豆参考基因组序列和一些重测序结果,但有关大豆DGAT家族的全基因组鉴定,特别是它们功能的详尽分析还知之甚少。本文应用生物信息学工具在全基因组水平上鉴定大豆DGAT家族成员,并利用qPCR分析各成员在大豆不同组织器官以及干旱、高盐和低温等胁迫条件下的时空表达谱。以酵母TAG合成缺失突变体H1246为受体(are1,are2,lro1和dgat1等4个基因突变体),分别超表达大豆DGAT基因,鉴定各成员的酶活性,并饲喂不同的酰基-CoA和DAG测试各成员的底物特异性。同时提取转基因酵母的微体酶蛋白,同位素标记反应底物,in vitro检测各大豆DGAT酶蛋白的底物选择性。应用Agro-infiltration侵染烟草(Nicotiana tabacum)叶片背面,分别瞬时表达各DGAT成员,in vivo鉴定其功能。应用TLC和GC分析各样品中TAG和各脂肪酸的含量。从大豆基因组中共鉴定出3个GmDGAT1(GmDGAT1-A,B和C),5个GmDGAT2(GmDGAT2-A,B,C,D和E),2个GmDGAT3(GmDGAT3-A和B)。GmDGAT1s和GrnDGAT2s为膜结合酶蛋白,而GmDGAT3s为可溶性酶蛋白。GmDGAT1-A在发育种子前期高表达,而GmDGAT1-B在发育种子后期高表达。干旱和盐胁迫上调叶片等营养组织中GmDGAT1的表达。GmDGAT2-A在发育种子中表达,但表达量低于GmDGAT1。GmDGAT2-B和D在叶片、茎和根中高表达。低温胁迫上调GmDGAT2-B的表达。GmDGAT3-A在根和叶片中高表达,盐胁迫上调根中GmDGAT3-B表达。酵母体系检测显示,这些表达的DGATs均有较高的酶活性。GmDGAT1-A和B分别对油酸和亚油酸有较高的选择性。GmDGAT2-A,B和D分别对棕榈酸、硬脂酸和亚油酸有较高的底物特异性。GmDGAT3-A和B对各底物选择性无明显差别。GmDGATs瞬时超表达均能显著提高烟草叶片中TAG含量,但各个DGAT超表达导致烟草叶片中脂肪酸成分变化差异较大,特别是GmDGAT3-A和B过表达引起烟叶原本没有的一些脂肪酸积累。总之,大豆基因组3个GmDGAT家族共10个成员中,有4个未检测到表达和酶活性。具有活性的各GmDGAT家族成员行使功能的主要组织器官以及对不同环境胁迫的响应存在显著差异。可见,大豆全基因组复制产生的多个DGAT同源基因,不仅提供了TAG合成功能的冗余性,而且经长期进化和选择,一些同源基因变成假基因,另一些同源基因的表达和功能发生明显分化,显示出大豆DGAT介导TAG合成积累及调控的可塑性和新特征。这为全面认识植物TAG合成调控机制和大豆种子油脂的分子育种提供了新见解和科学参考。