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目的 每年,麻醉药物被广泛用于上百万婴幼儿的医疗过程中.然而,麻醉药对婴幼儿 大脑发育的影响尚未明确,这仍是现代麻醉群体关注的焦点和患儿家属主要的担 忧.回顾性研究发现在幼儿期接受过手术或麻醉的青少年比同龄人在学习和记忆 方面表现更差.氯胺酮是一个N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体阻断剂,是小 儿麻醉最常用的药物之一.它被常规用于手术室内外麻醉的诱导和维持.普遍认 为氯胺酮有有效的麻醉和镇痛特性,作用时间短,血液动力学和呼吸系统安全可 靠.但是,大量的动物实验报道反复使用临床计量的氯胺酮会加重未成熟大脑的 细胞凋亡,但其具体的分子机制尚不清楚. 方法 在实验中我们使用的是Sprague-Dawley(SD)大鼠,其中出生后第七天(P7)的 大鼠和怀孕中的母鼠被用来研究氯胺酮对大脑发育的影响.实验分组处理设计如 下：1.生理盐水； 2.氯胺酮； 3.YC-1(HIF-1α抑制剂)4.氯胺酮+YC-1.每个 P7大鼠在六小时内每间隔90 分钟注射10ml/kg计量的氯胺酮,共注射四次.停 药后24 小时,P7 大鼠被腹腔内注射100mg/kg 处以安乐死.随后,我们立即将 大鼠的脑组织分离并冷冻于液氮中,用于之后的蛋白质分析.待大鼠成熟后,每 组10 只大鼠通过水迷宫试验(MWM)来评价其学习和记忆能力.为了确定氯 胺酮对HIF-1α 表达的影响,我们做了蛋白质印记(Western blot)和实时PCR(real-time PCR)来检测其蛋白质和mRNA 的表达水平.接着,我们使用了生 物信息学方法预测可能调节HIF-1α 表达的micro-RNA,并发现miR-199a-5p 是 我们的目标的micro-RNA.我们通过过表达以及抑制miR-199a-5p 来研究其对 HIF-1α 的调控作用.此外,我们通过荧光酶素报告实验来证明miR-199a-5p 和 HIF-1α的相互作用.我们最后通过细胞增殖实验和Annexin V/PI 双染凋亡细胞 检测实验检测神经细胞的增殖以及凋亡情况态,以此来确认HIF-1α 是否通过促 进神经细胞的凋亡从而影响大脑的发育. 结果 在我们的研究中,我们首先验证了氯胺酮对于新生大鼠认知功能的影响.通过水 迷宫实验,我们发现,氯胺酮处理能够引起新生大鼠的认知功能障碍.实验结果 同时提示了,重复使用治疗剂量的氯胺酮能够引起大鼠HIF-1α蛋白的表达改变,而HIF-1α蛋白在神经凋亡的过程中起到了重要的调控作用.为了研究HIF-1α在 氯胺酮引起的认知功能障碍中的确切作用,我们利用其抑制剂YC-1 观察抑制了 HIF-1α的功能后氯胺酮处理是否仍能影响大鼠的认知功能.结果 提示HIF-1α直 接介导了氯胺酮引起的认知功能障碍.由于HIF-1α 的表达调控机制尚不清楚,我们通过生物信息学分析预测调控器表达的microRNA,结果提示miR-199a-5p 可能调控HIF-1α 的表达.通过过表达以及干扰miR-199a-5p 我们验证了其对于 HIF-1α的表达调控作用.并且,通过荧光素酶报告实验,我们证实了miR-199a-5p 直接作用于HIF-1α mRNA 的3UTR 区域.PCR 结果进一步证实氯胺酮处理能够下调miR-199a-5p 的表达,同时western 结果提示抑制miR-199a-5p 能够增强 HIF-1α 的表达.需要注意的是,虽然我们证实了miR-199a-5p 直接调控HIF-1α 的表达,但仍不排除其他的表达调控机制的作用.我们通过MTT细胞增殖实验 以及Annexin V/PI 双染凋亡细胞检测等实验研究氯胺酮以及miR-199a-5p 对于 神经细胞增殖以及凋亡的影响.结果 提示miR-199a-5p 能够通过调节HIF-1α 的 表达从而促进神经细胞的凋亡.因此,我们认为氯胺酮通过下调miR-199a-5 能 够显著增高HIF-1α的表达,过表达的HIF-1α介导了促进神经细胞的凋亡的作用,从而导致了大鼠的认知功能障碍.因此可以得到结论：氯胺酮引起的认知功能障 碍的分子生物学过程中,miR-199a-5p/HIF-1α 轴起到了关键作用. 结论 总而言之,我们的研究解释了氯胺酮引起认知功能障碍的分子机制：miR-199a-5p 的下调可以增加其下游HIF-1α 的表达,从而促进神经细胞的凋亡.因此氯胺酮 是通过miR-199a-5p/HIF-1α轴引起患者认知功能障碍.我们的研究为多次、长时 间使用氯胺酮可能产生的认知功能障碍提供了新的证据,并为预防以及治疗因氯 胺酮所引起的神经损伤提供了新的靶点.