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目的:乌头碱是一种来源于众多乌头属植物的具有生物活性的主要双萜类生物碱.本次研究的目的是评价给予乌头碱是否可以诱发大鼠体内外心肌细胞的凋亡,并且探索乌头碱诱发凋亡的可能机制.
方法:乌头碱的促凋亡作用通过在成年大鼠心脏组织中的透射式电子显微镜(TEM)观察及在新生大鼠心室肌细胞(NRVMs)中的细胞毒性测试进行直接评估,并通过测定成年大鼠心脏组织中的肌酸激酶(CK)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)及无线遥测技术实时监测心电图进行间接评估.为了证明乌头碱的促凋亡效果,我们研究了包括Bcl-2、Bax、ERK、P-ERK、Caspase-9、Caspase-3及P53在内的凋亡相关蛋白的表达.此外,为了探索钙超载在乌头碱诱导凋亡中的作用及其作用靶点,使用IonWizard的肌节长度及钙瞬变模块进一步进行了肌节收缩及细胞内钙瞬变幅度的实时同步测定,探索了包括钙离子释放通道ryanodine受体(RyR)及钙离子ATP酶(SERCA)在内的肌浆网(SR)钙离子转运相关蛋白和细胞膜Na+/Ca2+交换体(NCX)等被认为是导致钙超载潜在靶点的蛋白表达情况.
结果:乌头碱治疗(O.OluM、0.04 uM、0.16 uM、0.64 uM)剂量依赖性的增加了原代NRVMs中LDH的水平并诱导了细胞的凋亡.在成年大鼠心脏组织中,乌头碱(1.46mg/kg,lOml/kg,每天给药一次,共10天)治疗也增加了CK、AST、LDH的水平及包括Bax、ERK、P-ERK、Caspase-9、Caspase-3及P53在内的促凋亡蛋白质的表达并减少了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达.此外,通过透射式电子显微镜在乌头碱治疗大鼠的心脏组织中观察到了促凋亡效果的显著增加.在钙超载方面,对分离成年大鼠心室肌细胞进行乌头碱治疗(luM)在最初几分钟内时间依赖性的增加了肌节收缩及细胞内钙离子瞬变幅度,而在最后几分钭随着细胞内钙超载的产生,肌节收缩幅度降低,肌节收缩功能障碍.乌头碱(1.46mg/kg,lOml/kg,每天给药一次,共10天)治疗也时间依赖性的增加了RyR的表达,但没有明显影响SERCA和NCX的表达.
结论:以上结果提示乌头碱可通过上调RyR蛋白表达,促进RyR钙离子的释放进而诱导大鼠心肌细胞凋亡.