目的：近年来,痘苗病毒天坛株作为抵抗感染性疾病(如人免疫缺陷病毒)疫苗的载体方面得到极为广泛的应用.然而,因免疫痘苗病毒后产生的种痘后副作用较大,有少部分群体种痘后会并发脑炎等严重症状.因此,通过基因工程方法,获得更加安全有效的痘苗病毒天坛株基因工程疫苗,成为一个重要的研究方向. 方法：研究人员用基因打靶技术，定向敲除痘苗病毒天坛株基因组中的目标基因。本实验基于传统的痘苗病毒天坛株，分别构建了TC7L-TK2L基因和TA35R基因缺失弱毒毒株MVTT1,MVTT2和MVTT3。并对重组病毒的毒性进行T体内和体外分析。首先在BHK-21,Vero,MDCK,HeLa和PK15五种细胞中，对MVTT1,MVTT2,MVTT3和野生型VTT的扩散能力及细胞毒性通过结晶紫染色实验和MTT实验进行分析。然后，通过鼻内和颅内感染途径分析MVTT1,MVTT2,MVTT3和野生型VTT的体内毒力，测量小鼠体重下降程度及小鼠的死亡数;皮内感染家兔皮肤分析MVTT1,MVTT2,MVTT3对家兔皮肤的损伤程度。对重组病毒进行了致病性评测后，继续进行免疫原性评测。以BALE/c小鼠为动物模型，检测血清中IL-2,IL-4,IL-10和IFN-y的含量和特异性抗体水平，并进行攻毒保护实验，分析小鼠的免疫水平，进而评价MVTTl,MVTT2和MVTT3的免疫原性。 结果：利用Cre-LoxP系统，成功构建了TC7L-TK2L基因和TA35R基因缺失型MVTTl MVTT2和MVTT3，且均具有良好的遗传稳定性。电镜观察结果表明缺失TC7L-TK2L基因和TA35R基因不影响病毒形态。根据结晶紫染色实验和MTT检测细胞存活率的体外实验结果，表明敲除了TC7L-TK2L和TA35R两段基因的重组病毒的扩散效率下降，对细胞的杀伤能力下降，细胞毒性下降。通过称量小鼠体重，验证出MVTT3减毒100倍;通过测量小鼠ICLD50,验证出MVTT3减毒3200倍。此外，细胞因子检测和中和试验结果表明，敲除TC7L-TK2L和TA35R两段基因后的重组病毒作为抗原刺激机体，没有降低免疫应答水平，仍可诱导产生较高水平的IL-2,IL-4,IL-10和IFN-ro并可刺激小鼠体内抗体的产生和分泌，保持了其作为疫苗的免疫原性。攻毒保护试验结果表明，敲除TC7L-TK2L和TA35R两段基因后的疫苗仍具有较高的保护效力。 结论：本实验基于VTT，在不引进外源标记基因的条件下，首次同时缺失TC7L-TK2L和TA35R两段基因，使VTT减毒，但保持了野生型病毒的免疫原性，筛选出的MVTT3对治疗多种传染性疾病和肿瘤具有广阔的前景。