【摘 要】
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目的:利用能量共振转移技术(FRET),构建蛋白激酶C活化分析模型,通过不同甲状旁腺素信号通路模拟肽的刺激,分析判断nonPLC/PKC通路可能的组成情况.方法:通过双酶切凝胶电泳方法构建含有甲状旁腺素受体的荷载质粒pcDNA3.1(+)-PTHR,转染HEK293细胞,通过G418筛选建立稳定转染细胞株.将检测PKC活化的荧光质粒CKAR转染稳定转染细胞株,表达48h后,通过不同的甲状旁腺素模拟
【机 构】
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南方医科大学南方医院脊柱骨科,广州 510515
【出 处】
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第十届中国南方骨质疏松论坛暨重庆市医学会骨质疏松年会
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目的:利用能量共振转移技术(FRET),构建蛋白激酶C活化分析模型,通过不同甲状旁腺素信号通路模拟肽的刺激,分析判断nonPLC/PKC通路可能的组成情况.
方法:通过双酶切凝胶电泳方法构建含有甲状旁腺素受体的荷载质粒pcDNA3.1(+)-PTHR,转染HEK293细胞,通过G418筛选建立稳定转染细胞株.将检测PKC活化的荧光质粒CKAR转染稳定转染细胞株,表达48h后,通过不同的甲状旁腺素模拟肽刺激,并在共聚焦显微镜下采集荧光信号图像,通过检测PKC是否得到活化,分析nonPLC/PKC通路的可能组成.根据FRET的实验结果,通过甲状旁腺素模拟肽和阻滞剂刺激MC3T3-EI细胞,采用RT-PCR分析,对以上的实验结果进行深入的分析.
结果:100nmol/LG1R19(1-34)和1μmol/L GIR19(1-28)刺激甲状旁腺素受体稳定转染细胞,可使PKC活化.当加入10μM/L的Rp-cAMP阻滞PKA的活化1.5小时后,重复以上的刺激,G1R19(1-34)仍可以引起PKC活化,但G1R19(1-28)未能使PKC活化.将5ng/ml的活性PKA(α+β)加入后,1μmol/L的G1R19(1-28)再次引起PKC活化.
结论:nonPLC/PKC通路的激活可能通过两种机制:一是PKA依赖的,与PTH(1-28)相关;二是PKA非依赖性的,与PTH(29-34)相关.本研究发现了PKC与PKA信号通路的交叉作用,将引起人们对PTH成骨信号通路的再认识.
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