【摘 要】
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病毒感染宿主后,病毒蛋白在体内可以诱导体液免疫应答,因此,揭示各种病原蛋白在体内诱导体液免疫应答的机制是病毒抗原学研究的重要内容之一.随着免疫技术的发展与应用,目前研究报道了多种研究抗原学的高通量技术,其中酵母展示表达技术是最近发展的平台之一.酵母表面展示系统具有以下突出优点：1.酵母细胞是真核表达系统,能够保证抗原蛋白的正确加工折叠和糖基化修饰,更有利于保留蛋白的抗原性；2.酵母细胞本身个体较大
【机 构】
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中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室;福建农林大学研究生院 中国农业科学院哈
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病毒感染宿主后,病毒蛋白在体内可以诱导体液免疫应答,因此,揭示各种病原蛋白在体内诱导体液免疫应答的机制是病毒抗原学研究的重要内容之一.随着免疫技术的发展与应用,目前研究报道了多种研究抗原学的高通量技术,其中酵母展示表达技术是最近发展的平台之一.酵母表面展示系统具有以下突出优点：1.酵母细胞是真核表达系统,能够保证抗原蛋白的正确加工折叠和糖基化修饰,更有利于保留蛋白的抗原性；2.酵母细胞本身个体较大,能够展示较多的重组蛋白,有利于利用磁珠或流式细胞仪的方法对抗原进行筛选；3.能够进行高通量操作.目前NDV是危害我国家禽养殖业的重要病原,其膜蛋白在宿主体内诱导体液免疫应答的机制如何,目前还不清楚,有必要通过抗原学研究揭示这一机制.研究目的：通过将NDV基因Ⅶ的HN膜蛋白进行随机片段化后连接于酵母表达载体,构建可用于酵母展示表达的真核表达文库,并确定连接于酵母载体上的HN片段的随机性和库容量,为将来研究HN蛋白的抗原性奠定基础.研究方法：从NDV中提取RNA后制备cDNA,通过特异性引物从cDNA中扩增HN基因.利用DNase Ⅰ将HN基因随机切割成100-250bp的小片段后连接于PCTcon-2酵母表达载体,然后将构建好的文库转入DH5 α菌株确定该文库的库容量大小,并通过随机挑选多个克隆进行测序确定连接片段的大小和随机性.实验结果：利用PCR扩增方法我们成功克隆了新城疫病毒的HN基因,其大小为1716bp.HN基因通过DNase Ⅰ随机酶切后回收,通过电泳确定其酶切片段大小主要介于100-250bp之间.将获得的HN随机片段连接于pCTCON-2酵母表达载体,然后将连接产物通过电转化方法导入DH5 α大肠杆菌,取部分重组菌按照10倍梯度稀释后涂板培养,确定其库容量为3x105,挑取其中100个单克隆进行测序,结果显示所克隆的片段介于100-200之间,并且随机分布于HN基因上.上述结果表明,我们成功构建了NDV HN膜蛋白的酵母表达系统的随机展示文库.该结果为我们今后对HN进行免疫学研究奠定了基础.
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