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目的:构建不同高拷贝数重组表达质粒并转入酵母,以比较研究人凝血因子Ⅶ(FⅦ)蛋白在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达时,表达单元拷贝数与表达量之间的关系。
方法:通过对单拷贝表达质粒进行改造,将表达单元(5-AOX-FⅦ-TT-3)重复导入载体,构建2-5个表达单元串联的高拷贝重组菌体,探讨表达单元拷贝数与表达量之间的关系。并进行了15L发酵中试培养,比较不同拷贝数酵母在发酵罐培养中的表达情况。
结果:构建获得pPIC9K/FⅦ表达单元串联的2-5个不同拷贝数的高拷贝重组酵母。摇瓶表达显示,随着拷贝数的增加,FⅦ表达量呈抛物线状增加。在15L发酵罐中,5个拷贝数的重组体不如单拷贝重组体生长旺盛,并发生了溶菌现象。发酵产物经超滤脱盐浓缩后的活性测定表明表达的重组FⅦ有生物活性,并且活性随蛋白浓度增高而呈递增趋势。
结论:构建含高拷贝数表达质粒的工程菌可提高毕赤酵母FⅦ表达量,此为获取低成本有活性的重组FⅦ提供了一条新的途径。