【摘 要】
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目的在本室构建的基因敲除大肠杆菌中克隆表达硫氧还蛋白还原酶,构建一株对环境中氧还循环反应剂超敏感的大肠杆菌菌株。方法以野生型大肠杆菌MC4100为模板用PCR方法扩增出硫
【机 构】
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温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室;
【基金项目】
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浙江省科技厅重点项目(2004C23018)
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目的在本室构建的基因敲除大肠杆菌中克隆表达硫氧还蛋白还原酶,构建一株对环境中氧还循环反应剂超敏感的大肠杆菌菌株。方法以野生型大肠杆菌MC4100为模板用PCR方法扩增出硫氧还蛋白还原酶基因,以pBAD为表达载体构建pBAD-TrxB重组载体,并转化人突变株大肠杆菌。利用蛋白N端的His-Tag纯化出硫氧还蛋白还原酶并用DTNB法测定其体外活性。用不同浓度的吩嗪硫酸甲酯作为氧还循环反应剂来测定突变株大肠杆菌转化前后的敏感性,从而反映出硫氧还蛋白还原酶的体内活性。结果 pBAD-TtxB重组载体经测序与NCBI中硫氧还蛋白还原酶标准序列完全一致。表达纯化后的蛋白样品经SDS-PAGE电泳结果显示在35．4kDa处有单一条带产生。硫氧还蛋白还原酶活性测定反应体系中分别加入经纯化后的酶的样品,变性后的酶的样品及空白样品在25℃,412nm波长下吸光度值在反应前100s内分别由0．8265,0．2131,0．6601升高至4．5,0．5878,0．6692。pBAD-TrxB重组载体转化的突变株大肠杆菌在吩嗪硫酸甲酯的作用下较未转化的突变株大肠杆菌的IC50为小。结论硫氧还蛋白还原酶以NADPH为还原当量,在大肠杆菌细胞内将环境当中的氧还循环反应剂还原为过氧化物和过氧化氢,使突变株大肠杆菌对环境当中的氧化应激敏感性增强,为进一步开发检测环境污染物的生物传感器奠定基础。
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