【摘 要】
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目的 建立一种实时荧光定量PCR方法检测肿瘤细胞中叶酰聚谷氨酸合成酶(FPGS)的mRNA表达,研究甲氨蝶呤(MTX)对映体(L (+)-MTX和D-(-)-MTX)耐药细胞株中FPGS的基因表达差异
【机 构】
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230001合肥,安徽医科大学附属省立医院安徽省立医院安徽省临床检验中心
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目的 建立一种实时荧光定量PCR方法检测肿瘤细胞中叶酰聚谷氨酸合成酶(FPGS)的mRNA表达,研究甲氨蝶呤(MTX)对映体(L (+)-MTX和D-(-)-MTX)耐药细胞株中FPGS的基因表达差异,并用于临床观察白血病患者MTX治疗耐药前后FPGS的mRNA表达水平变化. 方法 用SYβR Green Ⅰ为荧光染料,以β-actin作参照,建立检测FPGS mRNA的实时荧光定量方法；根据循环阈值(Ct值)、标准曲线相关系数、斜率、重复性曲线、熔解曲线、扩增效率曲线等进行方法学评价；并用该方法检测MTX对映体耐药细胞株及应用MTX耐药的白血病骨髓细胞中FPGS基因表达. 结果 建立的标准曲线Ct值与模板浓度有良好的线性关系,FPGS和β-actin标准曲线相关系数分别为0.9968和0.9987,斜率分别为-3.595和3.740,批内变异系数(CV)为1.27％～2.95％,批间CV为3.82％,熔解曲线均呈单个特异峰,扩增效率相似(斜率为0.0217)；L-(+)-MTX耐药细胞和D-(-)-MTX耐药细胞中FPGS相对含量分别为A549亲本细胞的3.51±0.66倍和0.16±0.01倍,两组间差异具有统计学意义(P＜0.01,q-9.29).白血病患者应用MTX耐药后FPGS相对含量是用前的0.35±0.04倍,两组间差异具有统计学意义(P＜0.01,t-8.83).结论 建立的实时荧光定量PCR检测FPGS mRNA的方法重复性好、特异度高、稳定性好、简单易行且成本低廉,可用于FPGS基因含量分析；MTX诱导耐药后细胞株及白血病患者骨髓细胞中FPGS基因表达发生了变化且在两种对映体细胞株间具有手性差异.
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