福寿螺多功能纤维素酶基因egx的克隆及其体外功能表达

来源 :中国畜牧兽医学会养猪学分会第五次全国会员代表大会暨养猪业创新发展论坛 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lijie04113209
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[目的]克隆福寿螺多功能纤维素酶基因egx,并在大肠杆菌和哺乳动物细胞中进行表达分析。[方法]通过RT-PCR的方法,从福寿螺胃组织total RNA中克隆福寿螺多功能纤维素酶egx基因序列,连接到克隆载体Pmd18-T,再通过EcoRⅠ和NotⅠ两个酶切位点分别与表达载体Pet-32a,(+)及pcDNA3.1(+)连接,构建原核、真核表达载体,并在Ecoli BL-21(DE3)和猪肾细胞PK15中进行表达,最后采用DNS法测定表达产物酶学活性。[结果]测序结果表明,RT-PCR扩增得到1326 bp的序列,包括1185 bp的编码序列和部分侧翼序列,编码序列与已报道的福寿螺多功能纤维素酶基因Cdna序列相似性为99%,氨基酸序列相似性为100%。原核细胞表达产物经包涵体复性后,对羧甲基纤维素钠、2-羟乙基纤维素、羟乙基纤维素、微晶纤维素、木聚糖的水解活性分别为:24.78U/mg、15.67U/mg、18.42U/mg、600.91U/mg、175.43U/mg;而在PK15细胞中重组酶对以上五种底物的活性分别为:0.84U/Ml、0.78U/Ml、1.01U/Ml、14.62U/Ml、4.23U/Ml。[结论]克隆了福寿螺多功能纤维素酶基因,并成功在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达,为福寿螺多功能纤维素酶的深入研究及广泛应用奠定了基础。
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