【摘 要】
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目的:研究小鼠支持细胞(TM4)中睾丸组织特异性诱导型热休克蛋Hsp70-1基因(Hsp70-B)启动子控制的miRNA干扰载体以及干扰载体在43℃热激条件下启动表达miRNAs干扰uPA基因的表达情况.方法:以Hsp/miR-HSP70-2载体为模板PCR方法扩增Hsp70-B启动子,并进行测序验证,将成功获取的Hsp70-B启动子取代pGL3-BasicCMV启动子,依据有效的uPA-siRN
【机 构】
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华中科技大学同济医学院计划生育研究所;华中科技大学同济医学院生殖医学中心 430030;武汉同济生殖医学专科医院
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目的:研究小鼠支持细胞(TM4)中睾丸组织特异性诱导型热休克蛋Hsp70-1基因(Hsp70-B)启动子控制的miRNA干扰载体以及干扰载体在43℃热激条件下启动表达miRNAs干扰uPA基因的表达情况.
方法:以Hsp/miR-HSP70-2载体为模板PCR方法扩增Hsp70-B启动子,并进行测序验证,将成功获取的Hsp70-B启动子取代pGL3-BasicCMV启动子,依据有效的uPA-siRNA序列,设计合成MIR-30结构寡核苷酸序列,构建睾丸组织特异性诱导型热休克蛋白Hsp70-1基因(Hsp70-B)启动子控制的miRNA-uPA干扰载体.
结果：成功构建睾丸组织特异性诱导型热休克蛋白Hsp70-1基因启动子控制的pGL3-Basic-Hsp70B-EGFP-MIR30-uPA干扰载体，实验组pGL3-Basic-Hsp70B-EGFP-MIR30-uPA干扰载体)、阴性对照(Hsp70-B)(靶向(pGL3-Basic-Hsp70B-EGFP-MIR30- NC)、空白载体(pGL3-Basic-CMV-EGFP)分别转染TM4细胞，Hsp70B在43℃热激3min即可启动同时并不影响支持细胞的增长。
结论：除热激本身导致细胞超微病理结构的变化而影响uPA蛋白及mRNA表达量。将组织特异性、可逆性及时空表达调节相结合，为建立uPA沉默双向开启可控的动物模型打下基础，可望实现睾丸组织内uPA基因表达的有效调控，干扰精子发生等多种生理过程，达到男(雄)性避孕的目的，进而可能发展“基因避孕”药物。
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