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目的:肿瘤化疗是治疗肿瘤的重要手段之一,它大大提高了一些肿瘤治愈的可能性.然而,肿瘤细胞耐药(Drug resistance)往往导致化疗的失败.肿瘤细胞对一种药物耐药后,往往也会对不同化学结构和不同作用机制的药物同时耐药,这就是多药耐药(Multidrug resistance).目前,研究MDR的机理成为肿瘤研究的主攻方向,其中由多药耐药基因(mdrl)编码的分子量为170kD的P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)过度表达是肿瘤细胞耐药的主要机制.因此,抑制或调节P糖蛋白功能和表达是逆转肿瘤细胞MDR的关键.盐酸千金藤碱(Cepharanthine Hydrochlorid,CH)是从防己科千金藤属植物的块根中提取分离的一种双苄基异喹啉类单体化合物,具有较强的多种生物活性.最近国外研究显示其具有逆转多药耐药的作用,其逆转白血病细胞的多药耐药机制是否与P糖蛋白有关,目前尚未见报道.本实验采用细胞和分子生物学的检测方法,观察CH对肿瘤细胞耐药性的逆转作用,并对MDR的分子机制进行深入探讨.
方法:实验选择人慢性粒性白血病细胞株K562及由阿霉素(Adriamycin,ADR)诱导的具有稳定MDR表型的耐阿霉素细胞株K562/ADR.采用MTT(3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenylte-2H-tetrazoloum bramide,MTT)分析法,测定ADR单用及分别与CH、维拉帕米(Verapamil,VER)合用对K562、K562/ADR细胞的直接细胞毒作用;采用流式细胞术测定CH单用及与ADR合用对K562细胞、K562/ADR细胞内P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表达水平的影响;采用阿霉素蓄积实验,流式细胞仪测定CH作用下,细胞内阿霉素蓄积量的变化;采用罗丹明123蓄积和泵出实验,测定细胞内蓄积罗丹明123的荧光强度,分析CH对P-gp功能的影响.通过上述实验阐明K562/ADR细胞对ADR产生耐药性与P糖蛋白表达和功能的关系及CH逆转耐药性的机理.
结果:
1.ADR对K562、K562/ADR细胞的细胞毒作用采用MTT法测定ADR对K562、K562/ADR细胞的细胞毒作用,其IC50值分别依次为0.45±0.01μmol·L-1和13.97±0.30 μmol·L-1,耐药倍数为31.04倍,二者比较差异有显著性(P＜0.05).
2.CH、VER分别与ADR合用对K562、K562/ADR细胞毒的影响单用CH、VER对K562及K562/ADR的细胞毒作用较弱,其结果为:CH4 μmol·L-1时抑制率为(5.72±0.31)％和(5.26±0.76)％,VER 4 μmol·L-1时抑制率为(4.10±0.45)％和(3.95±0.20)％.ADR与4 μmol·L-1CH合用对K562细胞的IC50值为0.44±0.02 μmol·L-1,与单用ADR比较差异无显著性(P＞0.05);对K562/ADR细胞的IC50值为1.88±0.10 μmol·L-1,与单用ADR比较差异有显著性(P＜0.05),逆转倍数为7.43倍.ADR与4 μmol·L-1VER合用对K562细胞的IC50值为0.46±0.03 μmol·L-1,与单用ADR比较差异无显著性(P＞0.05);对K562/ADR细胞的IC50值为6.27±0.17 μmol·L-1,与单用ADR比较差异有显著性(P＜0.05),逆转倍数2.23倍.CH合用组与VER合用组对K562/ADR细胞的抑制作用比较差异有显著性(P＜0.05),CH的逆转作用强于VER.
3.CH对K562/ADR细胞阿霉素蓄积的影响流式细胞仪测定0、2、4、8 μmol·L-1CH分别与5 μg/Ml ADR合用后,K562/ADR细胞内ADR的荧光强度分别为3.1、7.4、16.5和22.8,各组之间有显著性差异(P＜0.05).
4.CH对K562、K562/ADR细胞P糖蛋白功能的影响采用罗丹明123蓄积和泵出实验检测应用CH前后P糖蛋白功能的变化,Beckman流式细胞仪对细胞进行分析,以细胞内蓄积的罗丹明123荧光强度为量化指标.罗丹明123蓄积实验,0、2、4、8 μmol·L-1CH组和4 μmol·L-1VER组,K562细胞内罗丹明123的荧光强度分别为81.5、81.4、81.7、81.3和81.2,K562/ADR细胞内罗丹明123的荧光强度分别为16.9、25.3、44.7、60.7和23.1;K562细胞各组之间无显著性差异(P＞0.05),K562/ADR细胞各组之间有显著性差异(P＜0.05).罗丹明123泵出实验,0、4、8 μmol·L-1CH组和4 μmol·L-1 VER组,K562细胞内罗丹明123的荧光强度分别为77.0、77.2、76.8和77.4,K562/ADR细胞内罗丹明123的荧光强度分别为4.0、7.4、13.7和4.9;K562细胞各组之间无显著性差异(P＞0.05),K562/ADR细胞各组之间有显著性差异(P＜0.05).
5.CH对K562、K562/ADR细胞P糖蛋白表达的影响采用流式细胞术对P糖蛋白表达量进行分析,K562细胞加和不加荧光标记P糖蛋白单抗的P糖蛋白表达百分率分别为0.3％和0.3％,差异无显著性(P＞0.05),说明K562细胞中无P糖蛋白表达;对于K562/ADR细胞,0、2、4、8 μmol·L-1CH组和4 μmol·L-1 VER组,P糖蛋白表达百分率分别为94.5％、94.6％、94.4％、94.5％和94.1％,不同浓度CH组之间P糖蛋白表达无显著性差异(P＞0.05),说明CH对P糖蛋白表达无影响.
结论:
1.CH可部分逆转K562/ADR细胞的耐药性.CH与ADR合用降低ADR对K562/ADR细胞的IC50值,逆转倍数为7.43倍,强于VER的逆转作用.
2.CH处理细胞后,K562/ADR细胞内ADR的蓄积量随着CH浓度的增加而增加.
3.CH浓度变化不影响K562细胞中罗丹明123的蓄积和泵出;K562/ADR细胞随着CH浓度的增加,细胞内罗丹明123的蓄积增加,泵出减少.CH逆转K562/ADR细胞的耐药作用与抑制P糖蛋白的功能有关.
4.K562细胞中P糖蛋白无表达,而K562/ADR细胞P糖蛋白较高表达;CH逆转K562/ADR细胞的耐药作用与P糖蛋白的表达无关.