多酶偶联反应体系因其整体催化的高效性己成为酶催化领域发展的趋势和研究热点之一。多酶偶联反应体系解决了底物在多个单一酶间的传递问题,减小传质距离,缩短了底物的转运时间和反应时间,减少原料和能源的消耗,提高了各单酶的催化效率。人工构建高效的异源多酶偶联反应系统也是合成生物学的主要研究内容之一^[1]。该技术的发展是生物催化朝纵深发展的方向,也进一步拓展了酶催化的应用领域和空间,其研究成果在医药、食品、环境保护、生物材料等领域具有广阔的应用前景。然而,一个完整高效的人工多酶反应体系,不仅需要多种不同来源、不同功能的酶,还需要将这些酶进行最优化组装,使其按照一定的分子比例和空间结构有序地排列在一起,形成一个有机的多酶复合体。近年来,研究者通过蛋白支架、DNA支架、RNA支架、病毒支架、层层包埋、共固定等,在胞外成功构建了多个人工多酶反应系统。如Millner等^[2]通过不同长度的DNA支架将葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶连接起来,使其反应速率提高20多倍;Liu等^[3]利用相互作用蛋白,成功构建了三元蛋白支架,并将醇脱氢酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶有序的固定在支架上,使得NADH的生成速率提高了5倍。胞内利用蛋白支架介导的组装技术构建人工多酶反应体系的研究最近也有一些报道,如Dueber等^[4]利用信号蛋白构建蛋白支架,将甲羟戊酸途径酶组装起来,使其在低酶浓度下产量提高77倍。与蛋白支架介导的胞内蛋白组装相比,采用相互作用多肽或蛋白介导的无支架自组装技术操作更简便、组装效率更高。胞内无支架自组装技术最大的优势在于可以实现胞内蛋白聚集体的快速规模化制备,这对于构建具有生物学功能的人工超分子器件,特别是对通过构建人工多酶偶联反应体系来实现产品的工业化生产而言是极为重要的。然而目前该方法主要被用于单一蛋白的自组装形成具有生物学功能的超分子器件,如蛋白质材料、生物传感器、蛋白复合体等。而用于在胞内将异源多酶自组装形成人工多酶耦合反应体系的研究则较少。本实验室近期利用亮氨酸脱氢酶（LDH）自聚形成八聚体及甲酸脱氢酶（FDH）自聚形成二聚体的特性以及SHM蛋白对的相互作用,将LDH与FDH在大肠杆菌细胞内无支架自组装成高度有序的多酶聚集体,使辅酶NADH的循环效率提高了一倍多^[5]。我们还采用自组装技术,通过SHM相互作用蛋白的介导,在胞内对角鲨烯环氧酶（ERG1）与达玛烯二醇合酶（PgDDS）进行了共同定位,增强PgDDS对2,3-氧化角鲨烯的竞争性,减少2,3-氧化角鲨烯的扩散损失,PgDDS和ERG1在酵母脂质颗粒（LP）上自组装能够进一步拉近两个酶的距离,最终达到2倍产量的提高^[6]。这些研究证明,采用该技术,异源多酶可以在胞内自组装成具有一定结构的、排列有序的多酶体,且组装后可以提高多酶反应体系的催化效率。我们还将土曲霉来源的合成衣康酸的关键酶-乌头酸酶和乌头酸脱羧酶分别与PDZ与PDZlig进行了融合,并在大肠杆菌中进行了共表达自组装,使其静息细胞催化柠檬酸合成衣康酸的产量提高了3倍,说明组装后对衣康酸的合成能力有显著提高^[7]。通过无支架自组装技术还可以实现异源多酶在胞内的定位自组装,我们以氧化葡萄糖酸杆菌为宿主细胞,利用多酶自组装的方法将两个参与赤藓糖生物合成的级联酶-异源的核糖异构酶（L-RI）与该菌细胞膜上自有的山梨醇脱氢酶（SDH）通过自组装实现共定位,构建赤藓糖一步发酵的重组菌,大幅提高了赤藓糖在氧化葡萄糖酸杆菌中的产率和产量^[8]。结论:通过无支架自组装可以实现异源多酶在胞内构建成具一定结构及高效级联催化功能的人工多酶体。该研究技术具有一定的普适性,可以应用于其它异源多酶的胞内自组装,为在胞内构建新的高效人工多酶反应体系提供方法和依据。