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背景:自身抗体对于各种疾病的诊断、预后和监测都起到非常重要的作用。传统的方法如ELISA局限于对自身抗原的先验知识,很难发现新的自身抗体。此外,这种检测方法无法对几百种体液样本进行数百种抗原的高通量和多重分析,而基于抗原芯片的高通量检测方法在上述两方面均具有很大的潜力。目的:通过优化各种实验条件,建立一种快速、敏感、特异、高通量检测自身抗体的蛋白质芯片。方法:通过比较不同包被材料玻片产生的荧光信号,选取均一性好,信噪比高的包被材料作为后续试验的载体。查阅文献,选取与自身免疫性疾病相关的自身抗原作为捕获抗原,并优化其点样浓度。鼠抗人-dsDNA,-gliadin,-La/SSB,-H3,-Laminin mAB倍比稀释成14个浓度分别与抗原芯片孵育以考查其敏感性,并同时以ELISA方法做平行检测。将上述五种单克隆抗体与打印全部抗原后的芯片孵育,考查抗原抗体结合的特异性。将待测血清从1:50倍比稀释至1:25600后与构建的芯片孵育,通过GenePix4000B生物芯片扫描仪检测荧光信号。Cy3标记羊抗人IgG二抗与Alexa Fluor 680标记的羊抗人IgM二抗效价从1:2000稀释至1:7000,通过分析荧光信号确定最佳二抗稀释度,并对IgG、IgM同时检测是否相互影响进行评估。结果:根据检测结果优选均一性好、信噪比高的Expoxy玻片作为抗原芯片的载体。118种与自身免疫性疾病相关的自身抗原被选取并打印在同一玻片;大部分抗原的点样浓度为50μg/ml,个别为12.5μg/ml。血清稀释范围最高可达1:25600。抗体检测灵敏度可达0.002μg/ml,高于ELISA检测方法。单克隆抗体只特异性地与相应的抗原结合,与其他抗原无交叉反应。Cy3标记的羊抗人IgG、IgM使用效价分别为1:5000、1:4000;IgG、IgM抗体可同时检测,相互无干扰。结论:我们构建了一种简单快速、敏感度好、特异度强的高通量检测自身抗体的蛋白芯片,有助于发现新的自身抗体靶标及更深入地了解人类自身免疫性疾病。