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蛋白质磷酸化是一种最重要的翻译后修饰之一,在细胞的生理过程中发挥着重要作用[1]。过去几十年O-磷酸化(丝、苏、酪氨酸侧链磷酸化)的研究取得了重要的进展,近年来通过质谱手段在真核细胞中已经检测到>23000个磷酸化位点和>6500个蛋白[2]。虽然N-磷酸化(组、精、赖氨酸侧链磷酸化)的发现比O-磷酸化要早20年,但是,由于其酸、热敏感性,严重制约该研究领域的发展,质谱方法鉴定的研究更是寥寥无几,且集中于原核细胞[3,4],真核细胞的相关研究仍未见报道。碰撞诱导解离(CID)是一种广泛使用的二级碎裂方式,在对蛋白的深度覆盖研究中发挥了重要作用。然而由于其能量较高,往往导致翻译后修饰以中性丢失的方式解离,从而影响位点的确定。近年来发展起来的电子转移解离(ETD)是一种相对温和的二级碎裂模式,能够很好的保留后修饰信息,从而实现准确定位。而将ETD和HCD(高能碰撞解离)结合起来(EThcD),则能够克服ETD碎裂不完全和只适用于电荷>+2的多肽的缺点,大大提高多肽的覆盖率;而基于中性丢失触发的二级碎裂则称为Trigger模式,可以提高修饰鉴定水平。基于已有文献基础[5,6],目前,本实验室利用生物质谱技术,对不同刺激条件下的人Jurkat细胞中N-磷酸化位点和相关蛋白进行分析,系统考察了N-磷酸化蛋白在不同质谱条件,尤其是不同二级裂解模式中的检测情况。通过分别微调CID、EThcD及Trigger模式的参数,对Jurkat细胞蛋白经trypsin酶切和TiO 2富集后的多肽进行质谱检测,结果表明:CID-2方式可以鉴定到最多的位点,EThcD-1模式次之而多肽的鉴定质量能够提高(图1)。基于这两种方式,我们在Jurkat细胞中检测到123个蛋白上的161个N-磷酸化位点,且发现在氧化应激条件下N-磷酸化的水平上调,通过GO分析初步揭示N-磷酸化广泛涉及到与RNA相关的细胞过程中。