研究背景：糖尿病膀胱病(diabetic cystopathy, DCP)在糖尿病人群中发生率在25%-85%之间,是糖尿病患者最常见的慢性并发症之一。临床表现为膀胱过度活动、排尿困难等症状,输尿管返流、肾积水,产生肾功损害能和尿路感染。尿路感染是糖尿病患者常见死亡原因。可见糖尿病膀胱影响病人正常社会活动,危害病人生理及心理健康,严重影响病人的生活质量,甚至威胁生命。DCP的发病机制较为复杂,包括膀胱功能障碍和尿道功能障碍两个方面,具体表现为膀胱逼尿肌损伤、尿道括约肌改变、神经功能障碍以及氧化应激损伤等方面。DCP的发生与血管、周围神经病变关系密切。神经生长因子(nerve growth factor, NGF)研究发现主要在交感神经中表达,对维持周围神经正常功能有重要作用。既往国内外研究均提示NGF可能在糖尿病膀胱病排尿障碍病变中起重要作用。ProNGF是NGF的前体,NGF/ProNGF通路在尿道功能障碍中是否发挥作用,仍然值得进一步研究。研究发现糖尿病大鼠尿道收缩压基线升高,使用α1肾上腺素受体拮抗剂可以降低尿道收缩压基线。糖尿病尿道中分子水平α1受体表达情况尚不清楚。DCP的发生除尿道功能障碍的影响外,膀胱功能障碍也至关重要。近期研究提示糖尿病膀胱功能障碍在很大程度上是由于膀胱逼尿肌神经、受体发生改变。大麻素受体(cannabinoid receptors, CB receptors)是内源性大麻素系统的重要组成部分,CB受体可以影响多种细胞内信号转导通路,包括抑制腺苷酸环化酶、抑制钙通道、激活钾通道、激活MAP激酶通道等。在心血管系统、免疫调节、疼痛信号传导、能量代谢以及神经递质传递等多个方面发挥重要作用。越来越多的证据表明大麻素受体可能在膀胱中存在并且在膀胱功能障碍中发挥重要作用,但在糖尿病膀胱分子水平变化尚不清楚。葡萄多酚(Grape Seed Proanthocyanidin Extracts, GSPE)是从葡萄子中提取的一种天然多酚类化合物。目前关于葡萄多酚的研究领域非常广泛,已涉及心脑血管系统、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎、肿瘤、神经系统等领域。研究证实葡萄多酚对于糖尿病外周神经病变起重要保护作用,葡萄多酚干预后,糖尿病大鼠运动神经元传导速度明显提高,并且伴随着糖基化终末产物的减少,严重的节段性脱髓鞘改变减少,施万细胞有所改善。葡萄多酚是否对糖尿病膀胱及尿道也有干预作用,目前缺乏相应的研究。第一部分 α1受体和NGF/ProNGF通路改变在糖尿病尿道功能障碍中作用的研究研究目的：通过建立大鼠糖尿病模型,研究糖尿病大鼠尿道中α1肾上腺能受体表达变化和NGF/ProNGF通路的改变,探讨糖尿病大鼠尿道功能障碍的机制。材料与方法：健康雌性SPF级Wistar大鼠,随机分为实验组、对照组两组,STZ链脲佐菌素建立糖尿病模型。饲养八周后,对两组大鼠进行膀胱尿道同步测压；应用α1受体阻滞剂后再次检测尿道压力变化。使用ELISA、RT-qPCR以及Western blot等方法检测两组大鼠尿道中α1受体(α1A、a1D)、神经生长因子(NGF)、ProNGF、P75受体、Sortilin表达情况。结果：实验组STZ诱导糖尿病大鼠八周后平均空腹血糖为445.72±28.58mg/dL,对照组大鼠空腹血糖96.84±18.25mg/dL,显著性升高(P<0.001),确认糖尿病大鼠模型建立。观察到糖尿病大鼠多食多饮多尿体重减轻,膀胱尿道重量高于对照组大鼠。膀胱尿道同步测压结果,糖尿病组膀胱收缩压明显低于正常对照组,尿道压高于对照组,应用坦索罗辛治疗后,尿道压力基线和尿道压力最低值均降低。α1a和ald mRNA水平在糖尿病大鼠尿道中表达升高。糖尿病大鼠尿道中α1a和ald蛋白水平升高。NGF mRNA水平在糖尿病大鼠尿道中表达显著性降低(P<0.05)；NGF蛋白水平也观察到在糖尿病大鼠尿道中表达显著性降低(P<0.05)。proNGF蛋白水平在糖尿病大鼠尿道中表达升高。P75NTR mRNA在糖尿病组中表达显著性降低(P<0.05)。P75NTR蛋白在糖尿病组中表达显著性降低(P<0.05),Sortilin表达没有显著性差异(P>0.05)。结论：在糖尿病大鼠尿道α1受体表达较对照显著增加,这可能是导致糖尿病鼠尿道压力增加的直接原因。NGF在糖尿病尿道中表达下降,proNGF表达增加。NGF/ProNGF通路改变可能是导致糖尿病尿道功能障碍的发生的原因。推测在糖尿病大鼠NGF/proNGF信号通路的改变引起的交感神经的损伤,从而上调尿道中α受体的表达,进而导致糖尿病鼠尿道压力增加。第二部分 糖尿病膀胱中大麻素受体的研究研究目的：研究糖尿病大鼠膀胱中大麻素受体1和大麻素受体2(CB1和CB2)的表达改变。探究大麻素受体激动剂和抑制剂对于糖尿病大鼠膀胱平滑肌肌条收缩功能的影响。材料与方法：建立糖尿病大鼠模型,将八周糖尿病组大鼠和正常对照组处死,取膀胱和背根神经节。用qRT-PCR和Western blot的方法分别从mRNA和蛋白水平检测膀胱和背根神经节中CB1和CB2的表达情况。用混合性的CB1/CB2激动剂R(+)-WIN 55,212-2 (WIN)、选择性CB1拮抗剂(AM251)以及CB2拮抗剂(AM630)分别处理糖尿病组和正常对照组大鼠膀胱平滑肌肌条。AM251和AM630预处理的膀胱肌条加用WIN后,观察肌条收缩变化。结果：Western blot结果显示大鼠膀胱组织中,糖尿病大鼠组中CB1和CB2蛋白水平较正常对照组显著降低(P<0.05)。背根神经节中,糖尿病组CB1表达显著降低(P<0.05),CB2表达没有显著性差异。提示CB1在糖尿病大鼠膀胱中和背根神经节中的表达都显著性降低,CB2在膀胱中的表达显著性降低,在背根神经节表达无显著性差异。qRT-PCR结果大鼠膀胱中,糖尿病大鼠组中CB1和CB2蛋白水平较正常对照组显著降低(P<0.001)。背根神经节中,糖尿病组CB1表达显著降低(P<0.01),CB2没有显著性差异(P=0.22)。CB1在糖尿病大鼠膀胱中和背根神经节中的表达都降低,CB2在膀胱中的表达降低,在背根神经节表达没有变化。膀胱离体逼尿肌肌条实验证实糖尿病膀胱逼尿肌肌条的收缩幅度和收缩频率较正常膀胱逼尿肌肌条组显著降低(P<0.05)。WIN以浓度依赖的方式抑制对照组及糖尿病组膀胱肌条的收缩幅度。随WIN浓度的增加膀胱逼尿肌肌条收缩的频率增加。溶剂对各组膀胱逼尿肌收缩无影响。此外,WIN对收缩幅度的影响在糖尿病不显著(P<0.05)。WIN对膀胱离体逼尿肌收缩幅度的影响可以被AM251部分阻断,AM630对其无明显影响。结论：CB1和CB2在大鼠膀胱组织和背神经根中的存在,CB1在糖尿病大鼠膀胱中和背根神经节中的表达都显著性降低,CB2在膀胱组织中的表达显著性降低,在背根神经节表达无显著性差异,提示CB1和CB2在糖尿病膀胱病变中可能发挥一定作用。CB1、CB2表达改变可能导致膀胱传入神经的损伤,引起糖尿病膀胱功能障碍。第三部分 葡萄多酚对糖尿病膀胱尿道保护作用及分子机制的研究研究目的：探究葡萄多酚对糖尿病膀胱功能是否具有保护作用,并解析葡萄多酚(GSPE)的作用机制。材料与方法：30只雌性wistar大鼠随机分为三组(对照组、STZ诱导8周糖尿病组、GSPE灌胃糖尿病组)；运用膀胱尿道同步测压的方法测定三组大鼠膀胱和尿道压力；测定三组大鼠膀胱中SOD和GSH-Px活性以及MDA含量；检测大鼠膀胱中Nrf2和HO-1蛋白水平的表达情况；制作大鼠膀胱切片, Tunel法测定膀胱组织中细胞凋亡情况,同时检测凋亡相关蛋白Bc12和Bax蛋白水平的表达情况；检测神经生长因子NGF以及proNGF在大鼠膀胱尿道的表达。结果：尿流动力学检查的结果显示,GSPE治疗组糖尿病大鼠膀胱最大收缩力较糖尿病组明显好转(P<0.05)。大鼠膀胱HE染色结果显示,糖尿病组大鼠膀胱粘膜结构异常,炎细胞浸润,固有膜充血明显,同时逼尿肌肌束排列紊乱；GSPE治疗后,大鼠膀胱粘膜炎症减轻,逼尿肌排列整齐。糖尿病大鼠膀胱较正常对照组相比, GSH-PX、SOD活性显著降低,MDA含量显著升高(P<0.05)；GSPE治疗后糖尿病大鼠膀胱氧化应激状态明显改善,GSH-PX,SOD活性显著升高,MDA含量降低(P<0.05)。免疫组织化学法以及Western blot结果都表明,GSPE治疗后,糖尿病大鼠膀胱中Nrf2表达显著升高,Nrf2下游分子HO-1的表达也增加(P<0.05)。TUNEL细胞凋亡检测结果显示,糖尿病组大鼠膀胱细胞较正常对照组凋亡增多,GSPE治疗后,可减少糖尿病大鼠膀胱中细胞凋亡水平(P<0.05)。细胞凋亡相关蛋白Bcl-2在糖尿病组膀胱表达显著降低,GSPE治疗后表达升高；Bax在糖尿病组膀胱表达显著升高,经GSPE治疗后表达降低。GSPE治疗组大鼠膀胱和尿道中NGF表达量升高, proNGF表达降低(P<0.05)。结论：GSPE可以显著改善糖尿病膀胱收缩功能,这一作用可能是通过激活Nrf2通路,降低膀胱细胞凋亡,促进NGF表达,改善膀胱神经功能实现的。同时,葡萄多酚可以通过NGF/ProNGF通路改善糖尿病大鼠膀胱尿道功能。