目的:建立能同时检测支原体通用型和肺支原体特异型的双通道荧光定量PCR方法。并在小鼠检测中进行应用。 方法：采用TaqMan探针法进行支原体通用型和肺支原体特异型的双通道荧光定量PCR。取大肠杆菌、表皮葡萄球菌、人巨细胞病毒、肺炎支原体、乙型肝炎病毒、大鼠、小鼠和人基因组等作特异性试验。对5个浓度分别为3个／μL、3×10个／μL、3x102个／μL、3×103个／μL、3×104个／μL的标本进行荧光定最PCR的敏感性试验。对197份小鼠气管标本、22份经支原体培养后的标本，进行支原体和肺支原体的双通道荧光定量PCR法检测。荧光定量PCR阳性产物纯化后.通过测序来验证结果。 结果：确认支原体和肺支原体双通道荧光定量PCR引物和探针序列为，引物：5’-19bp-3’、5’-19bp-3’;探针：支原体通用型为5FAM-21bp-3’-BHQ-1，肺支原体为5’-HEX--22bp-3’-BHQ-1。与大肠杆菌、表皮葡萄球菌、人巨细胞病毒、肺炎支原体、乙型肝炎病毒、大鼠、小鼠和人基因组等均无交叉反应。最低可检测到10个肺支原体。在气管标本中检测到肺支原体阳性3份;培养标本中检测到肺支原体阳性3份(其中2份同气管标本);219份标本中5份通用型支原体阳性(肺支原体阴性)，提示标本中含有其它种类的支原体。6份肺支原体PCR阳性标本，经测序对比，与肺支原体序列一致。 结论：建立了能同时检测支原体通用型和肺支原体特异型的双通道荧光定量PCR方法，检测快速(3小时以内获得结果)，敏感性高。为实验动物小鼠的高效管理提供了有力的保障。