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目的:肝刺激因子(hepatic stimulator substance, HSS),也称为肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration, ALR),是从新生动物肝脏或部分肝切除术后的残余肝脏中提取的一种活性蛋白。HSS是一种热稳定蛋白,具有抗酸、耐碱的特性。研究表明,肝损伤后HSS表达增加,可以刺激残余肝细胞增殖,促进肝再生。HSS只刺激肝细胞或肝源性肿瘤细胞增殖,对其他组织细胞或非肝源性肿瘤细胞则无刺激作用,说明其作用具有组织特异性。此外,HSS能够保护肝细胞,减轻CCl4、半乳糖胺、硫代乙酰胺等药物对肝细胞的损伤。虽然对HSS的保肝功能有了一定了解,但作为一种肝源性生长因子,HSS在肝再生中扮演的角色尚未明了,有待深入研究。本实验利用肝部分切除术制备鼠肝再生模型,观察HSS在肝再生过程中的变化;通过体内RNAi技术,抑制HSS表达,观察抑制HSS表达对肝再生的影响。实验之目的在于探讨HSS与肝再生之关系及可能的作用机制。方法:采用小鼠70%肝脏切除(partial hepatoectomy, PH)的方法建立肝再生模型。检测在肝再生过程中肝再生率的变化;以超声波方法检测肝脏面积以及肝内血流改变;以生化方法测定血清中谷氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和门冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)的水平;以PCNA免疫组化法检测肝细胞增殖状况,以HE染色观察肝细胞形态学的改变,辅以电子显微镜观察肝细胞超微结构变化。将PH小鼠随机分为三组:对照组,HSS RNAi组和HSS组。对照组的小鼠在PH后于肝右叶多点注射100μg的pG PU6/GFP/Neo-negative control质粒;HSS RNAi组小鼠于PH后肝右叶多点注射100μg的pG PU6/GFP/Neo-sh RNA HSS RNAi质粒;HSS组小鼠PH后肝右叶多点注射50μg pcD NA3.0-Flag-h HSS质粒。结果:(1)PH后5 d时注射阴性对照质粒组动物肝再生率达93.605±1.843%,注射HSS RNAi质粒组动物肝再生率达73.752±3.005%,HSS转染质粒组动物肝再生率达97.000±0.453%。PH后7 d时注射阴性对照质粒组动物肝再生率达99.069±0.128%,注射HSS RNAi质粒组动物肝再生率达94.032±1.782%,HSS转染质粒组动物肝再生率达105.118±0.614%。HSS组与对照组比较PH后3～5d肝再生率变化有统计学意义(P<0.05)。RNAi组与对照组比较PH后1～6 d肝再生率变化有统计学意义(P<0.05)。(2)利用超声方法检测再生肝脏的面积,以反映肝脏增长状况。结果显示,HSS RNAi组PH后1～7 d之内,小鼠肝脏冠状切、矢状切的面积比对照组小,而HSS组PH后1～7 d小鼠肝脏冠状切、矢状切的面积比对照组大。肝脏冠状切RNAi组、HSS组与对照组比较PH后1～6 d有统计学意义(n=3, P<0.05)。肝脏矢状切HSS组与对照组比较PH后1～6 d有统计学意义(n=3, P<0.05)。肝脏矢状切RNAi组与对照组比较PH后3～5 d有统计学意义(n=3, P<0.05)。干扰HSS后(RNAi组),再生肝静脉血流速度减慢,HSS组PH后门静脉血流速度加快,HSS组与对照组比较PH后1～4 d有统计学意义(n=3, P<0.05),RNAi组与对照组比较PH后2～4 d有统计学意义(n=3, P<0.05)。5～7 d血流速度变化无明显差异。(3)PH后第1 d血清ALT、AST明显升高,第2～7 d开始下降。PH后1 d注射阴性对照质粒组动物血清ALT升高到1873.733±107.053 IU/L,注射HSS RNAi质粒组动物血清ALT升高到2461.667±178.878 IU/L,HSS转染质粒组动物ALT升高到1149.700±90.663IU/L。PH后3 d注射阴性对照质粒组动物血清ALT升高到122.500±7.216 IU/L,注射HSS RNAi质粒组动物血清ALT升高到352.500±52.446 IU/L,HSS转染质粒组动物血清ALT升高到108.667±14.106 IU/L。PH后1 d注射阴性对照质粒组动物血清AST升高到2099.900±121.0839 IU/L,注射HSS RNAi质粒组动物血清AST升高到2877.000±159.729 IU/L,HSS转染质粒组动物AST升高到1502.033±210.394 IU/L。PH后3 d注射阴性对照质粒组动物血清AST升高到202.388±4.602 IU/L,注射HSS RNAi质粒组动物血清AST升高到294.033±24.681 IU/L,HSS转染质粒组动物血清AST升高到186.866±15.147 IU/L。与对照组比较1～2 d血清ALT、AST变化有统计学意义(P<0.05)。术后3～7 d血清ALT、AST变化无显著差异。(4)肝组织HE染色结果可见HSS RNAi组PH后第1～3d脂滴多;第3、5、7 d核分裂相减少,而HSS组PH术后l d脂滴少,第3、5、7 d可见较多的核分裂相细胞,对照组PH后第1～3 d脂滴多,第3、5 d可见较多的核分裂相细胞,第7 d仅见少量的核分裂相细胞。(5)肝部分切除术后免疫组化检测结果可见三组动物肝脏组织切片中PCNA标记指数的高峰均出现在术后第2 d。第7 d时各组的PCNA都降到较低的水平。HSS RNAi组PH后1～7 d PCNA数值均低于对照组相应时间点的PCNA。HSS组PH后1～7 d PCNA值高于对照组相应时间点的PCNA (P<0.05)。提示注射HSS有可能加速再生肝脏DNA合成。(6)肝组织电镜结果可见HSS RNAi组肝细胞线粒体膜损伤加重,同时胞内脂滴明显增多。而HSS组肝细胞线粒体膜损伤减轻,脂滴减少。虽然对照组动物肝脏线粒体亦有损伤,但损伤程度不及HSS RNAi组。结论:小鼠PH后干扰HSS表达可影响肝再生,增加HSS表达加速肝再生速率,反之则抑制。PH后上调表达HSS表达促进肝细胞增殖的机制可能与HSS保护线粒体功能有关。