目的：商陆种子抗病毒蛋白(PAP—S)是由美洲商陆的种子中分离出的一种广谱抗病毒蛋白,对多种动植物病毒,包括RNA、单链DNA和双链DNA病毒均有抑制作用。目前临床应用的抗HBV药物存在副作用较多、长期应用可产生耐药突变等缺陷,且均不能抑制位于核内的HBV cccDNA。因此,寻找新型抗病毒药物依然是慢乙肝临床研究的重要部分。HBV核心蛋白(HBc)的C端含有核定位信号,可引导其进入核内。本文旨在探讨全长PAP蛋白及PAP-HBc融合蛋白在HBV转基因小鼠模型体内抗HBV的效果。
　　方法：以PGEM—PAP质粒为模板设计引物,PCR扩增得到全长PAP基因,经酶切、连接后测序确认。以已测序的全长PAP质粒及HBc质粒为模板设计引物,PCR扩增PAP-HBc融合基因,与PMD-18T载体连接并转化,经酶切鉴定及DNA序列检测均证实为目标序列。将原核载体pET-28a与构建好的克隆用BamH I和HindⅢ双酶切,连接酶切产物,经测序证实得到pET-28a—PAP—HBc原核质粒。将全长PAP、全长PAP—HBc融合质粒转化至大肠杆菌BL21,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后经镍离子亲和层析柱分离纯化,得到目的蛋白。给药前,将24只HBV转基因小鼠按照血清HBV DNA和HBsAg水平配对,分为阴性对照组、拉米夫定组、PAP组(0.125mg/kg)及PAtLHBc融合蛋白组(0.125mg/kg)。持续给药45天,于给药第15、30、45天及停药15天后自眼眶静脉丛采血,荧光定量PCR法检测小鼠血清中HBV DNA含量,ELISA法检测血清}tBsAg水平； 取小鼠肝、肾组织,行HE染色观察给药后肝、肾组织的病理变化,免疫组化染色计算肝脏HBsAg阳性细胞的数量,teal time RT—PCR测肝组织中HBV复制中间体mRNA水平。
　　结果：构建的全长PAP基因的原核表达质粒、PAP—HBc融合基因原核表达质粒经双酶切及测序,证实各基因正确地插入到载体中,且读码框正确。诱导分离纯化得到的蛋白,经SDS—PAGE检测证实为目的蛋白。与生理盐水组相比,45天时PAP组、PAP—HBc融合蛋白组对血清HBVDNA的抑制率分别为73％(P<0.01)、77％(P<0.01)； 对HBsAg的抑制率分别为24.7％(P<0.01)、27.2％(P<0.01)。各组HE染色均未见肝。肾组织有明显病理变化。免疫组化染色显示PAP组及PAP—HBc融合蛋白组小鼠肝脏中HBsAg阳性细胞数量较生理盐水组减少。PAP组、PAP—HBc融合蛋白组的HBV mRNA较生理盐水组少。
　　结论：成功地构建了全长PAP基因及其与HBc融合的真核表达质粒,并纯化出原核表达蛋白。PAP及PAP—HBc融合蛋白在慢性HBV感染小鼠体内对HBV有抑制作用,并未见明显肝肾毒性。