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目的:先天性耳聋的发生率高达0.2%,约60%是遗传基因因素所致。对于遗传性耳聋的治疗,在原位对内耳细胞进行基因纠正,使其修复听力是最精准、理想的治疗方法。其中最大的挑战是如何将目的基因高效的送入活体内耳细胞。以腺相关病毒(AAV)为载体和基于蛋白质途径的耳聋基因治疗有安全性高等优势,我们的研究目的是以AAV为载体和基于蛋白质途径的耳聋基因治疗方法。方法:将12种不同血清型的AAV(AAV1,2,5,6,6.2,7,8,9,rh.8,rh.10,rh.39,and rh.43)注射入活体新生鼠和成年鼠,2周和3月后研究内耳AAV转染情况。将新型AAV(Anc80L65)注射入成年豚鼠,1个月后观察转染情况。将结合了脂质体2000的Cas9蛋白/guide RNA(sg RNA)注射入出生后1天Atoh1-GFP小鼠耳蜗,以免疫染色及测序研究CRISPR/Cas9蛋白系统对内耳细胞基因编辑的可能性和效率。结果:12种AAV对内耳细胞各有不同的转染效率,在新生鼠组,AAV2,5,rh.10对内毛细胞转染效率高,而AAV1,2,8和AAV2,6.2,rh.43分别对外毛细胞和支持细胞转染效率高,3月后注射组听力不变化;在成年鼠组,AAV1,8,9对内毛细胞转染效率高,而AAV1,2,8对支持细胞转染效率高。Anc80L65能高效转染成年豚鼠。将结合了脂质体2000的Cas9/sg RNA(针对GFP)注射入出生后1天的Atoh1-GFP小鼠耳蜗,发现有约20%的外毛细胞的GFP信号消失,二代测序证实了GFP基因的插入或敲除,说明Cas9蛋白高效的对毛细胞进行了特异的基因编辑。结论:AAV对内耳细胞转染效率高、安全性能高,不同血清型有不同的转染特异性和效率,新型Anc80L65能高效转染内耳毛细胞,可用于不同类型遗传性耳聋的基因治疗。Cas9蛋白能对活体内耳细胞进行特异的基因编辑。此方法可用来纠正遗传性耳聋的突变基因和用来研究内耳相关蛋白的功能,也可用来进行哺乳动物的内耳毛细胞再生的基因治疗。