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目的：研究益气解毒方对人鼻咽癌CNE-2Z细胞自噬和凋亡的影响,并初步探讨CNE-2Z细 胞自噬和凋亡之间的关系.方法：采用MTT法检测细胞存活率,AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测细胞凋亡,Western Blot法 检测凋亡和自噬相关蛋白Cleaved caspase-3、Bax,Bcl-2,Cleaved PARP、LC3、Beclin1和 PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达,MDC染色检测细胞自噬体的形成,透射电镜观察细胞 内自噬体和凋亡小体.结果：1益气解毒方对CNE-2Z细胞增殖的影响MTT结果显示,益气解毒方显著抑制CNE-2Z细胞增殖,并且抑制效应呈时间依赖性和浓度 依赖性.益气解毒方干预CNE-2Z细胞24h后,0.25、0.5、1、2mg mL-1细胞存活率分别为(74.39±1.94)％、(64.23±0.78)％、(54.35±1.57)％、(33.90±1.52)％和(20.92±1.56)％,与Control 组相比,差异均有统计学意义(p值均＜0.01)；干预48h后,细胞存活率分别为(67.34±0.36)％、(47.67±0.30)％、(36.93±7.18)％、(22.78±1.02)％和(14.54±0.22)％,与Control组相比,差 异均有统计学意义(p值均＜0.01).2益气解毒方对CNE-2Z细胞凋亡的影响(1)AnnexinⅤ-FITC/PI双染结果显示,0.5mg mL-1益气解毒方处理CNE-2Z细胞12h、24h、36h和48h后细胞凋亡率分别为(38.69±3.22)％,(54.30±6.93)％,(69.53±4.14)％和(80.87±4.15)％, 与Control组(1.11±0.83)％相比,差异均具有统计学意义(P值均＜0.01).10μM Z-VAD-fmk预 处理显著降低益气解毒方诱导的细胞凋亡率,Z-VAD-fmk预处理+益气解毒方组凋亡率为(14.30±3.07)％,益气解毒方组凋亡率(58.66±5.66)％,差异有统计学意义(p＜0.01).单纯使 用Z-VAD-fmk组(2.02±0.50)％与Control组(1.39±0.58)％相比,差异无统计学意义(p＞0.05).(2)Western Blot结果表明,0.5mg mL-1益气解毒方干预CNE-2Z细胞不同时间(12h、24h、36h和48h)后,Cleaved caspase-3、Bax和Cleaved PARP蛋白表达上调,而Bcl-2蛋白表达下降, 与Control组比较,差异均具有统计学意义(p值均＜0.01)； Z-VAD-fmk预处理+益气解毒方组 Cleaved caspase-3、Bax和Cleaved PARP蛋白表达下降,Bcl-2的表达上调,与益气解毒方组相比, 差异有统计学意义(p＜0.05和p＜0.01)).3益气解毒方对CNE-2Z细胞自噬的影响(1)MDC结果显示,益气解毒方作用于CNE-2Z细胞后荧光强度增加,药物干预12h、24 h、36h和48h后荧光强度分别为(0.044±0.009)、(0.078±0.010)、(0.053±0.010)和(0.030±0.007), 与Control组比较(0.011±0.008),差异均有统计学意义(p＜0.05和p＜0.01).(2)Western Blot结果显示,益气解毒方干预CNE-2Z细胞12h、24 h、36h和48h后,LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达较Control组增强,差异均具有统计学意义(p＜0.05和p＜0.01)；干预24h 时,LC3-Ⅱ,Beclin1蛋白表达水平最高.此外,干预24h时,益气解毒方组的PI3K, p-AKT,p-mTOR蛋白表达较Control组下调(p＜0.05和p＜0.01),与益气解毒方组相比,3-MA预处理+益 气解毒方组LC3-Ⅱ、Beclin1表达下调(p＜0.05和p＜0.01), PI3K,p-AKT,p-mTOR蛋白表达上 调(p＜0.05和p＜0.01).4 CNE-2Z细胞自噬与凋亡的相关性研究(1)透射电镜结果显示,益气解毒方干预CNE-2Z细胞12 h后细胞内出现少量自噬体,细 胞结构完整清楚；干预24h后,细胞内自噬体明显增多,细胞核开始出现固缩；干预36h后,细 胞内自噬体数量相对减少,细胞核明显固缩,胞浆内空泡增多；干预48h后,细胞内自噬体减少, 核固缩成块,细胞体积缩小并有出芽现象.(2)AnnexinⅤ-FITC/PI双染结果表明,3-MA抑制益气解毒方诱导的CNE-2Z细胞凋亡.与 Control组(1.66±0.76)％比较,3-MA组凋亡率为(1.97±0.68)％,差异无统计学意义(p=0.879)； 与益气解毒方组凋亡率(54.79±4.06)％比较,3-MA预处理+益气解毒方组的细胞凋亡率(19.40±2.59)％显著下降,差异有统计学意义(p=0.000).(3)Western Blot结果显示,与益气解毒方组比较,自噬抑制剂3-MA预处理+益气解毒方组 的凋亡蛋白Cleaved caspase-3、.Cleaved PARP和Bax表达水平下降,而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表 达水平则上调,差异均有统计学意义(p值均＜0.01)；与益气解毒方组比较,凋亡抑制剂Z-VAD-fmk预处理+益气解毒方组自噬相关蛋白LC3和Beclin1蛋白表达显著下降,差异均有统计学意义(p＜0.05).结论：益气解毒方抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞±曾殖并诱导细胞凋亡和自噬,其诱导细胞自噬 与激活PI3K/AKT/mTOR通路有关；益气解毒方诱导的细胞自噬可以促进细胞凋亡.