背景:anginex是利用碱基折叠原理和掺入来自PF-4、IL-8、BP1的β-片层域短序列相结合的方法,人工设计的一种新抗血管生成肽,具有高度选择性、低毒性和高渗性的特点,通过特异性作用于活化的内皮细胞,阻滞细胞的粘连和移行,导致细胞凋亡,抑制血管生成。在体内外的研究证明其抑制肿瘤新生血管生成的作用呈剂量依赖性,对正常血管系统和处于静止期的内皮细胞无生物活性。但是,anginex分子量小和半衰期短,需要持续用药才可以产生疗效。因此,在合成并把anginex cDNA序列插入到具有信号肽和前导肽的重组原核表达载体,构建可分泌表达抗血管生成肽anginex的表达盒,再以重组腺病毒为载体,构建了AdNT4-anginex,本研究利用体内外实验观察构建的AdNT4-anginex抑制细胞移行、鸡胚血管生成和抗肿瘤生长的作用。 方法:检测Ad-NT4-anginex的生物活性:[1]利用鸡胚绒毛尿囊膜试验观察AdNT4-anginex的抗血管形成作用;[2]利用划痕法观察AdNT4-anginex对人内皮细胞株ECV340移行的抑制作用;[3]对照观察AdNT4-anginex的抗移植肿瘤生长作用。15只雌性ICR小鼠接种制备的H22肝癌细胞株,待成瘤后,随机分为三组:第一组仅在一侧瘤体内注射AdNT4-anginex 0.1mg/kg;第二组双侧瘤体内注射AdNT4-anginex 0.1mg/kg;对照组不作任何治疗;[4]免疫组织化学SABC方法检测肿瘤组织内MVD,分析AdNT4-anginex抗肿瘤生长作用与肿瘤血管生成的关系。 结果 :[1]划痕法观察到AdNT4-anginex液+VEGF后,ECV340细胞株的移行被明显的抑制,整个移行过程缓慢,细胞爬满划痕的时间较对照组延长70％以上。对照组在加药后6小时,细胞已经完全爬满了划痕,而实验组细胞在24小时尚未完全爬满划痕。[2]鸡胚CAM方法观察到加AdNT4-anginex后第18天CAM的血管数量、管径和长度较正常CAM和对照组明显减少,呈叶脉状分布的血管网已经消失,环内可见大片的血管稀疏及无血管区,还可看到较粗的血管明显变细及中断,对照组血管明显增多及局部出血。[3]ICR小鼠荷H22肝癌细胞瘤后,第一组左侧肿瘤生长被明显的抑制,生长速度明显较对照组缓慢,但是对侧肿瘤也发生了同样的改变,肿瘤生长较治疗前有显著性差异(F=18.118,p=0.002),全部消失达60％(6/10),不能触及。[4]在第二组双侧肿瘤注射AdNT4-anginex后,双侧肿瘤局部注射药物后肿瘤生长较治疗前有显著统计学差异(F=14.777,p=0.004),较对照组肿瘤也有显著统计学差异(F=185.255,p=0.000),到第4周时肿瘤完全消失达70％(7/10),不可触及,而1号小鼠注射药物侧肿瘤反而略增大,对侧却完全消失。[5]单侧注射与双侧注射比较对肿瘤生长抑制作用无显著性差异(确切概率法,p=0.394)。[6]免疫组化检测显示试验组肿瘤组织中MVD数量明显少于对照组。 结论:AdNT4-anginex能明显的抑制人血管内皮细胞株ECV340的迁移和CAM血管生成,并发现对管径较粗的血管具有一定的破坏作用。有限的结果表明AdNT4-anginex可使anginex的稳定性提高、半衰期延长,抗血管生成和抗肿瘤生长作用增强。