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目的 探索内源性SO2对血管平滑肌细胞增殖的调节作用,并以cAMP/PKA和Erk/MAPK通路的交互作用为切人点,阐明SO2对血管平滑肌细胞增殖调节的可能机制.方法 以10％ FBS及PDGF-BB为刺激剂,检测SO2对大鼠胸主动脉平滑肌细胞活力和增殖的影响,评估不同浓度SO2对血管平滑肌细胞24、48及72小时细胞数量的影响,检测SO2对细胞周期及对平滑肌细胞DNA合成的影响.进一步在血管平滑肌细胞中过表达或敲低SO2生成酶天门冬氨酸氨基转移酶(AAT)1或2,检测PCNA蛋白表达、血管平滑肌细胞DNA合成、细胞周期蛋白cyclin D1表达及Erk1/2、MEK1/2、c-Raf(Ser338、Ser259、Ser43)磷酸化水平的改变.在体外实验中通过生物化学法直接检测SO2对c-Raf激酶活性,探索SO2抑制血管平滑肌细胞增殖的分子靶点,在细胞实验中采用腺苷酸环化酶激活剂Foskolin或PKA抑制剂H-89干预,检测磷酸化c-Raf(Ser259、Ser43)及磷酸化PKA水平,并同时检测细胞内cAMP含量变化及细胞增殖水平的改变,进一步揭示SO2抑制血管平滑肌细胞增殖的信号转导通路.结果 1)内源性SO2抑制血管平滑肌细胞增殖：SO2在5～100 μmol/L浓度范围内不影响大鼠血管平滑肌细胞的活力和凋亡,但在0-72小时内可以抑制FBS诱导的血管平滑肌细胞增殖.流式细胞学结果发现SO2干预使G0/G1期细胞比例增加,S期和G2/M期细胞比例下降,提示SO2可通过阻碍细胞周期G1期到S期的进展而抑制血管平滑肌细胞的增殖.BrdU标记法提示SO2可抑制平滑肌细胞S期的DNA合成能力.在血管平滑肌细胞中过表达SO2生成酶AAT1或AAT2可显著抑制FBS诱导的PCNA蛋白表达,并且减少BrdU的掺人；相反,shRNA敲低AAT1或AAT2则进一步上调FBS诱导的PCNA蛋白表达和S期DNA合成能力.而以PDGF-BB作为增殖诱导剂,同样发现SO2可明显抑制血管平滑肌细胞DNA合成,抑制细胞周期蛋白cyclin D1的表达.上述研究提示,内源性SO2可明显抑制血管平滑肌细胞增殖.2)ERK/MAPK信号通路与SO2抑制血管平滑肌细胞增殖的效应有关.研究发现SO2供体可抑制FBS及PDGF刺激的血管平滑肌细胞中Erk/MAPK信号通路三个主要信号分子Erk1/2、MEK1/2和c-Raf的磷酸化水平,提示SO2可能通过阻滞Erk/MAPK信号通路的活性从而抑制血管平滑肌细胞的增殖.但是体外实验结果证实,SO2无法直接抑制c-Raf以及MEK的活性,提示SO2对Erk1/2、MEK1/2以及c-Raf活性的抑制作用可能源于c-Raf的上游信号通路或其他因素的介导.3)cAMP/PKA是内源性SO2抑制血管平滑肌细胞中MAPK信号通路,进而抑制细胞增殖的分子靶点.进一步研究发现SO2明显上调PDGF-BB诱导的c-Raf抑制性磷酸化位点Ser259磷酸化水平.SO2供体可显著提高血管平滑肌细胞中PKA分子活性及细胞内cAMP含量,SO2的这一系列效应很一致地模拟了腺苷酸环化酶激活剂Forskolin的作用.而PKA抑制剂H-89则取消了SO2上调的c-Raf分子Ser259及Ser43位点的磷酸化水平和PKA分子活性,表明SO2对PKA信号通路的激活是因为提高了cAMP水平,激活cAMP/PKA信号通路.H-89抑制PKA的活性后,可明显逆转SO2对PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用.结论 内源性SO2可抑制血管平滑肌细胞增殖,且该抑制作用由cAMP/PKA及Erk/MAPK信号通路共同介导.