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胶霉毒素是一种具有广谱抑菌、抑病毒、抗氧化、强抗肿瘤活性和免疫调节活性的毒素,由胶霉毒素制备的杀菌剂和杀虫剂对防治水稻纹枯病、稻瘟病和稻曲病有很好的防治效果。胶霉毒素在治疗肝纤维化方面已经有应用,胶霉毒素类似物应用小细胞肺癌已经进入临床III期,证明胶霉毒素在生物医药领域有很好的应用前景。本课题组组前期在深海真菌埃德菌FS110的代谢产物中分离纯化得到了大量结构新颖的胶霉毒素及其衍生物,分离得到的胶霉毒素对肿瘤细胞具有显著的细胞毒性。在此基础上对埃德菌FS110进行了全基因组测序,本项目组对深海真菌D. cejpii进行全基因组测序。测序结果表明,所得碱基数为40,830,384,909 bp, Q20为98.87%,所得数据的测序单分子clean数据序列的长度分布统计如下图所示,说明本次测序质量较高,可用于后续分析,所得基因组大小为24.32M。GC含量为49.697%。FS110基因组共预测得到8550个基因。从FS110基因组结果中共获得88个与胶霉毒素生物合成相关的基因。预测Cluster18为胶霉毒素生物合成基因簇,与二酮哌嗪类化合物Aspirochlorine生物合成基因簇的相似度为13%。为了更好地解析FS110中胶霉毒素生物合成转录调控机制,并对其生物合成基因进行更好的异源表达,对其中胶霉毒素的生物合成基因启动子功能进行了分析。通过3-4次巢式PCR反应,筛选阳性克隆,获得gliG/gliI/gliO三个基因的启动子片段G1、G2、I1、I2、O1、O2并测序成功。寻找启动子核心区域,然后扩增出gliG/gliI/gliO三个功能基因的上游包括核心启动子区域200-700bp左右片段,如gliG基因上游500bp,gliI基因上游700 bp,gliO基因上游300 bp。萤火虫荧光素酶检测试剂得出,gliG核心启动子区域具有较高的转录活性。将启动子插入pGL3-basic载体中,将0.5 kb gliG核心启动子区域替换pGPDA启动子,将2μ-pAN7-1-gliG核心启动子载体以及2μ-pAN7-1载体(阳性对照)分别电转入酿酒酵母,含有2μ-pAN7-1-gliG核心启动子载体的酵母生长较快,而且菌落数较多。为了对胶霉毒素的生物合成基因进行基因编辑,我们成功构建了适用于海洋真菌FS110的PFC332-sgRNA载体和PX459-sgRNA-GFP-Ble载体。其中PFC332-sgRNA载体中加入了在酵母细胞中发挥作用的sg RNA靶向序列骨架基因;在PX459-sgRNA-GFP-Ble中加上了sg RNA靶向序列以及博来霉素抗性Marker,为后续突变菌株的筛选提供了更加可靠的筛选标记。gliG、gliI、gliO靶向序列的PFC332-sgRNA质粒成功导入到D. cejpii原生质体中,并且筛选出阳性克隆,利用潮霉素抗性基因引物克隆,得到gliG阳性克隆2个,gliO阳性克隆1个,并通过验证了目的基因gliG、gliO的成功敲除。本研究关于深海真菌FS110的基因组测序及胶霉毒素生物合成基因及其启动子的分析为FS110中胶霉毒素生物合成途径的阐明奠定了分子生物学基础。