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根据已发表的结核分枝杆菌23s rRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列，设计和合成了两对可扩增838bp和631bp目的片段的引物，建立了快速检测鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR方法。对牛分枝杆菌参考株和国内分离株进行扩增结果成功扩增出839bp和631bp的特异性基因片段；对人结核分枝杆菌只扩增出839bp基因片段而扩增不出631bp的特异性基因片段；对参试的基它牛的菌株DNA进行PcR扩增结果均为阴性。敏感性测定，该方法能检测到的敏感度可达到50pg的DNA含量。应用该方法对238份牛临床样品的DNA分别进行了二重PCR检测，结果有22份临床样品经PCR扩增检测为结核分枝杆菌阳性，其中含2份PCR扩增为牛分枝杆菌阳性，其它临床样品扩增结果全部为阴性。本方法可做为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。