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背景:多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)是以高雄激素血症为主要特征的一类多因性、临床表现多态性并可引起多种并发症的内分泌、代谢紊乱性疾病。其病因病机复杂多样,且目前尚无理想的治疗方案,因此积极探究PCOS的发病机制及其有效的治疗策略,是我们妇产科内分泌领域研究的重点和难点课题。俞氏清肝方是治疗PCOS的临床验方,在多年的临床实践中取得了满意的治疗效果,但其确切的药理作用及机制目前尚未明确,制约了其推广应用。目的:1.明确俞氏清肝方治疗"肝经湿热型"PCOS患者的临床疗效;2.探讨俞氏清肝方的有效药物成分黄芩苷对PCOS高雄激素血症的干预作用及可能的作用机制,为俞氏清肝方的临床推广应用奠定基础。方法:(一)开展临床试验研究,明确俞氏清肝方治疗"肝经湿热型"PCOS患者的临床疗效。(1)病例收集:2014.02~2015.12期间就诊于第二军医大学附属长海医院中医妇科门诊的"肝经湿热型"PCOS患者;(2)药物干预:将符合纳入标准的患者随机分为两组:中药组给予统一煎制的俞氏清肝方汤剂(1包/次,2次/日,口服,经期停服);西药组给予达英-35(1片/次,月经第4日开始,口服,连服21日);连续治疗3个月、随访3个月;(3)观察指标:观察两组患者治疗前后的月经周期、体重指数(body mass index,BMI)、腰臀围比(Waist hip ratio,WHR)、多毛、痤疮、黑棘皮症等临床症状,以及心烦、口干、便秘、经前乳胀、发油/脱发等"肝经湿热"症候的改善情况;比较两组患者治疗前后性激素主要包括睾酮(Testosterone,T)、游离睾酮(Free testosterone,FT)、硫酸脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone sulfate,DHEAS)、雌醇(Estrone,E1)、雌二醇(Estradiol,E2)、促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、促卵泡生成素(Follicle stimulating hormone,FSH)、性结合球蛋白(Sexual binding globulin,SHBG)、瘦素(Leptin,LEP)、空腹血糖(Fasting blood-glucose,FPG)、胰岛素(Insulin,INS)、胰岛素曲线下面积(Insulin area under curve,IAUC)、胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment for insulin resistance,HOMA-IR)以及胰岛素敏感指数(Insulin sensitivity index,ISI)等指标的变化情况;随访患者停药后3个月的排卵情况。(二)开展体内实验研究,观察黄芩苷对PCOS高雄激素血症模型大鼠的治疗作用,并初步探讨其可能的作用机制。(1)模型制备:采用颈背部皮下注射脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone,DHEA)的方法制备大鼠模型,根据阴道脱落细胞以及血清性激素水平筛选PCOS高雄激素血症模型大鼠;(2)药物干预:将造模成功的模型大鼠随机分为模型组、中药组和西药组,分别给予生理盐水(10mg/kg)、黄芩苷(100mg/kg)、螺内酯(20mg/kg)连续干预28天;(3)观察指标:药物干预结束后观察大鼠性周期、体重及卵巢系数的改变情况;酶联免疫ELISA法检测大鼠血清T、E2、LH、FSH等性激素水平的变化情况;对大鼠脏器组织的大体形态进行观察,显微镜下对大鼠肝肾及卵巢组织行HE染色病理形态学观察;(4)采用Real-time PCR及采用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)法对大鼠卵巢组织雄激素合成代谢关键酶3β-羟甾脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)、17a-羟化酶/17,20裂解酶(17 a-hydroxylase/17,20 lyase,CYP17)、细胞色素P450芳香化酶(Cytochrome p450 aromatase,CYP19)以及雄激素受体(Androgen receptor,AR)的mRNA和蛋白表达情况进行检测。(三)开展体外实验研究,探讨黄芩苷对NCI-H295R细胞的干预作用及其可能的调控机制。1.黄芩苷对NCI-H295R细胞表型及功能的影响(1)通过细胞活力实验检测黄芩苷的细胞毒性作用;(2)采用ELISA法检测黄芩苷对细胞雄激素合成功能的影响;(3)结合细胞活力及ELISA结果确定黄芩苷的最佳作用浓度和时间;2.黄芩苷调控NCI-H295R细胞雄激素合成的作用机制(1)采用基因表达谱芯片(Gene expression profile chip,GEPC)技术分析黄芩苷对NCI-H295R细胞相关功能基因表达的影响;并采用Real-time PCR法对GEPC结果进行验证;(2)采用GO-analysis、功能富集等生物信息学技术筛选黄芩苷调控的显著差异功能基因;(3)采用Real-time PCR及Western Blot法对该显著差异功能基因进行验证;3.黄芩苷调控3β-羟甾脱氢酶亚型Ⅱ(HSD3B2)基因转录的机制(1)采用调控序列系列缺失重组质粒构建、细胞瞬时转染、双荧光素酶报告基因检测法确定黄芩苷影响HSD3B2活性的重要调控区域;(2)生物信息学技术分析筛选HSD3B2基因重要调控区域的关键转录因子;(3)采用RNAi干扰、质粒共转染、双荧光素酶报告基因检测法验证该关键转录因子的转录活性以及黄芩苷的干预作用;(4)采用基因突变技术、质粒共转染、双荧光素酶报告基因检测法验证该关键转录因子的转录活性以及黄芩苷的干预作用;结果:(一)临床试验研究结果:1.本临床试验共收集"肝经湿热型"PCOS患者175例,其中脱落14例,排除36例,实际纳入中药组74例,西药组51例,两组患者基线资料一致,具有可比性;2."肝经湿热型"PCOS患者WHR增加,多毛、痤疮症状明显,部分患者伴有黑棘皮症;血清LH、LH/FSH、T、FT、E1、E1/E2、DHEAS水平及INS30min、INS60min、INS90min、INS120min、HOMA-IR及IAUC显著升高,SHBG水平显著降低;月经不调、经前乳胀、心烦易怒、口干口苦、发油/脱发症候明显:3.俞氏清肝方可显著降低患者血清LH、LH/FSH、T、FT、DHEAS水平及胰岛素30min,60min,120min水平,降低IAUC;改善患者痤疮症状以及月经不调、经前乳胀、心烦易怒、口干口苦、发油/脱发症候;促进排卵(排卵率为57.95%),有利于妊娠(治疗及随访期间9人妊娠,受孕率为12.16%)。其临床总有效率为89.19%。(二)体内实验研究结果:1.DHEA皮下注射可成功诱导PCOS大鼠模型(成功率为65.71%);2.黄芩苷干预后,模型大鼠动情周期得到一定程度的改善,体重基本相同的情况下卵巢湿重明显减轻;性激素T、LH、LH/FSH比值均显著降低;3.黄芩苷干预后,模型大鼠卵巢多囊样状态得到一定程度的改善,且无肝肾毒性;4.黄芩苷可抑制模型大鼠卵巢组织3β-HSD、CYP17及AR的mRNA及蛋白表达。(三)体外实验研究结果:1.黄芩苷对NCI-H295R细胞的IC50为275umol/L;结合黄芩苷对细胞雄激素合成功能的影响,确定其最佳干预浓度及时间为25umol/L、48h;2.显著差异功能基因HSD3B2为黄芩苷影响NCI-H295R细胞雄激素合成的效应靶基因;3.黄芩苷可能通过调控HSD3B2基因启动子重要调控区域(-507~-325bp)中的关键转录因子GATA-1的转录活性进而影响雄激素的合成。结论:1.俞氏清肝方对"肝经湿热型"PCOS具有显著的治疗效果,可显著逆转患者紊乱的内分泌水平,改善患者多种临床症状,促进排卵、有利于妊娠;2.俞氏清肝方的有效药物成分黄芩苷对PCOS高雄激素血症模型大鼠具有一定程度的治疗作用,且无肝肾毒性,安全性较好;初步探究其作用机制可能与抑制雄激素合成关键酶和/或影响雄激素作用媒介-雄激素受体的表达相关;3.黄芩苷可通过调控雄激素合成酶3β-羟甾脱氢酶亚型Ⅱ(HSD3B2)基因重要调控区域(-507~-325bp)中的关键转录因子GATA-1的转录活性进而抑制NCI-H295R细胞雄激素的生物合成。