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[目的]研究DNA烷基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase,mgmt)在双功能烷化剂氮芥(nitrogen mustard,NM)诱导DNA-蛋白交联(DNA-protein crosslink,DPC)形成中的作用、DPC形成特点及修复过程.[材料和方法]20 μMNM染毒人支气管上皮细胞16HBE,于染毒后1h、6h、24 h收集细胞,提取mRNA、蛋白及DPC,另设50 μM、100 μ.M、200 μM剂量梯度组及单功能烷化剂半硫芥对照组.mRNA、蛋白提取为常规方法,RT-PCR、Western blot法检测mgmt、γH2AX、修复相关DVC1、rad51 mRNA及蛋白的表达变化.DPC提取使用DNAiso,裂解细胞后根据说明书所述制备包含有交联蛋白的基因组DNA.取适量的基因组DNA,对交联的蛋白进行FITC标记,无水乙醇沉淀基因组DNA,75％乙醇漂洗后,以8 mM NaOH重新溶解沉淀.用狭缝印迹法将纯化的DPC吸附固定在预先铺设的NC膜上.利用FITC特异性抗体检测交联蛋白总量,狭缝印记固定定量但未标记FITC的DPC,利用特异的mgmt抗体检测交联的mgmt含量(mDPC).此外,转染mgmt、DVC1 siRNA后染毒,与正常染毒细胞对比DNA损伤修复蛋白的表达变化.[结果]半硫芥染毒后,mgmt蛋白表达升高,而NM染毒后,mgmt mRNA及蛋白表达则降低,但总DPC含量及特异性mDPC含量均呈现剂量依赖性升高.mgmt mRNA在染毒后下降时呈现1h、24 h较6h下降更明显的W形趋势,相反,mDPC在时间效应上则出现染毒后1h迅速升高,6h有所下降,但于24h又回升的M型曲线.γH2AX、蛋白水解酶DVC1、同源重组修复标志蛋白rad51在染毒后均明显升高,且与mDPC类似,在6h时表达量相对较少.在mgmt沉默细胞中,染毒前后各时间点γH2AX变化不明显,且都较mgmt正常表达的细胞弱,与此伴随的是蛋白水解酶DVC1在mgmt沉默后表达较正常细胞减弱,且下降迅速.[结论]mgmt在双功能烷化剂与单功能烷化剂致DNA烷化损伤中作用不同,在氮芥介导下,mgmt可与DNA形成交联,加重DNA损伤,并且呈剂量依赖性升高.细胞在染毒24 h内反应状态不一,6h有波动.DPC修复涉及蛋白水解和同源重组途径,活跃程度与DPC含量相吻合.