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良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)是老年男性的常见病,在60岁时发病率达50%,85岁时高达90%。BPH导致的下尿路症状(lower urinary tract symptoms,LUTS)干扰日常活动与睡眠,主要表现为排尿困难、尿急、尿频、夜尿增多以及尿失禁等,严重影响生活质量。BPH的发病机制至今仍不完全清楚。目前认为,BPH/LUTS 一方面是因增大的前列腺梗阻膀胱出口部位及前列腺尿道所致,称为静力因素;另一方面是由前列腺张力(主动张力与被动张力)增加与膀胱失代偿及过度活动引起,称为动力因素。两者在BPH/LUTS的发生发展过程中都起着重要作用。RhoA是一种小分子量三磷酸鸟苷酶,是小G蛋白家族的一员,在细胞信号转导的过程中起重要作用。Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase,ROCK)是 RhoA 最重要的下游分子。RhoA/ROCK通路被证实参与多种细胞功能,但是研究最为广泛的仍是其对平滑肌细胞收缩的影响。有研究表明RhoA/ROCK通路在梗阻膀胱、输尿管组织中表达增高,并导致其张力异常增加。最近的研究显示RhoA/ROCK通路在前列腺组织中有表达,而且与前列腺收缩功能有关。这提示RhoA/ROCK通路可能参与了 BPH的张力异常。有研究发现上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)参与 BPH的发生,导致间质细胞的累积。EMT是在特定细胞因子诱导下细胞由上皮细胞表型转化成间质细胞表型地过程,广泛参与胚胎发育、器官纤维化以及癌症侵袭转移等过程。转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是调控 EMT发生的重要细胞因子。有研究发现RhoA/ROCK通路可能影响TGF-β诱导的EMT反应。但是RhoA/ROCK通路及EMT在BPH发病进程中的作用尚不清楚。为证实RhoA/ROCK通路在BPH的发生及进展过程中的作用,揭示其作为BPH潜在治疗靶点的可能性,本研究通过在组织层面对RhoA/ROCK通路在BPH中的表达和舒缩功能进行研究,在细胞层面对其在前列腺上皮细胞EMT中的作用进行研究,在人体组织和细胞层面验证RhoA/ROCK通路在BPH中的作用。第一部分 人BPH组织中RhoA/Rho激酶通路的表达以及对收缩功能的影响目的:通过研究RhoA/ROCK通路在人前列腺组织中的表达及功能情况,证实RhoA/ROCK通路是否参与了 BPH发生发展,尤其是对BPH/LUTS的动力因素的影响,揭示RhoA/ROCK通路作为BPH导致的LUTS潜在治疗靶点的可能性。方法:收集临床手术获取的人增生前列腺和正常前列腺标本,通过病理染色和临床症状评分区分BPH组和正常组。通过聚合酶链式反应和免疫印迹的方法,检测RhoA/ROCK及其下游与收缩相关的肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)、肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)、蛋白磷酸酶 1 调节抑制亚基 14A(protein phosphatase 1 regulatory inhibitor subunit 14A,CPI-17)等的基因和蛋白水平的表达。通过免疫组化和免疫荧光的方法检测RhoA/ROCK在前列腺组织中的表达定位。在离体组织舒缩功能试验中,使用ROCK抑制剂Y-27632舒张前列腺组织条的收缩反应,同时用Y-27632预处理两组组织条,比较预处理后两组前列腺收缩反应之间的差异。结果:1)BPH组中RhoA和ROCK1的mRNA表达显著增高,其中RhoA的表达是正常组的1.5倍(P=0.009),ROCK1的表达升至正常组的1.8倍(P=0.045),其余分子的mRNA变化无统计学差异;2)与mRNA表达结果一致,BPH组RhoA和ROCK1的蛋白表达也升高,同时其下游的CPI-17和磷酸化的MLC表达也增高;3)免疫组化和免疫荧光的结果都显示,RhoA和ROCK1在前列腺的上皮和间质成分都有表达,而且在BPH组织中表达较为明显;4)无论在BPH组还是正常组,10 μM的Y-27632都能够显著舒张由10-5 M肾上腺素引起的前列腺组织条收缩,10 μM的Y-27632引起的BPH组肌条舒张效力可达34%,而在正常组舒张效力为18%,BPH组对Y-27632更为敏感。结论:人BPH组织表达更高水平的RhoA和ROCK1,并导致其下游收缩相关的分子表达增高,并参与了增生前列腺的张力异常,抑制ROCK的功能可以更显著地舒张BPH组的离体组织条收缩。第二部分RhoA/Rho激酶通路参与TGF-β诱导的前列腺上皮细胞EMT过程目的:通过研究RhoA/ROCK通路对TGF-β诱导的正常和增生前列腺上皮细胞发生的EMT的影响,提示BPH的可能发生机制,揭示RhoA/ROCK通路作为针对BPH病因地潜在治疗靶点的可能性。方法:收集临床手术获取的人增生前列腺和正常前列腺标本,用免疫组化的方法对EMT的标志分子上皮型钙粘蛋白(E-cadherin)、神经型钙粘蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)染色。TGF-β处理正常前列腺上皮细胞系(RWPE-1)和增生前列腺上皮细胞系(BPH-1),经过不同时间地处理后,检测EMT相关分子RhoA的mRNA表达。为了验证RhoA/ROCK通路对EMT地影响,将细胞随机分为四组:A组为对照组加入等体积磷酸盐缓冲液,B组加入10 μg/LTGF-βi,C 组加入 10 μg/LTGF-β1 和 10 μmol/LY-27632,D 组加入 10 μmol/LY-27632,处理48h检测EMT相关分子的表达。结果:1)增生前列腺腺上皮细胞E-cadherin的表达较正常组有所降低,而vimentin和N-cadherin在BPH组腺上皮中的表达增加;2)BPH-1和RWPE-1细胞系经过TGF-β的处理,随着处理时间的延长,E-cadherin表达逐渐降低,N-cadherin和vimentin表达逐渐升高;3)在两种细胞系中,RhoA的mRNA表达水平随TGF-β处理时间增加而逐渐升高;4)在BPH-1细胞系中,TGF-β和Y-27632共处理后E-cadherin表达较TGF-β处理后升高,升高约20%,N-cadherin和vimentin表达均降至接近对照组水平。在RWPE-1细胞系中,Y-27632同样逆转了 TGF-β诱导的EMT相关分子表达改变,但是均未恢复至对照组水平。结论:在人BPH组织中存在EMT现象,RhoA/ROCK通路参与了 TGF-β诱导的前列腺上皮细胞的EMT发生。