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目的：复制血管紧张素Ⅱ灌注小鼠高血压模型,采用病理学及分子生物学等技术检测心脏组织Atg5的表达及炎症细胞浸润,炎症因子表达;检测巨噬细胞自噬水平,巨噬细胞ROS产生及NF-κB的激活;观察心脏组织中胶原沉积及成纤维细胞的分化,明确Atg5对血管紧张素Ⅱ导致心脏损伤的调控作用.本研究旨在探讨Atg5对巨噬细胞线粒体自噬功能的影响及相关信号途径的调控,为寻找有效的临床干预措施提供理论和实验依据.
方法：1.研究对象分组:实验动物:雄性Atg5杂合小鼠(C57/BL6背景)16只,野生C57/BL6雄性小鼠16只.均随机分为2组(n=8):醋酸生理盐水溶液灌注组(Vehicle,对照组);血管紧张素Ⅱ灌注组(AngⅡ,处理组).2.小鼠高血压模型制备:采用微量泵进行血管紧张素Ⅱ灌注复制小鼠高血压模型,灌注速率1500ng/kg*min.3.血压测量:采用尾套管血压仪(Tai l-cuff)连续测定实验小鼠尾动脉血压.4.心脏功能测定:采用小动物超声心动仪测定小鼠心脏功能.5.心脏组织Atg5的表达:采用免疫组织化学染色方法和RT-PCR法检测心脏组织Atg5的表达.6.细胞中Atg5的表达:采用RT-PCR法检测心肌细胞,成纤维细胞,巨噬细胞中Atg5的表达.7.心脏组织炎症细胞因子表达:采用HE染色法检测心脏组织中炎症细胞的聚集情况.免疫组织化学染色方法检测Mac-2的蛋白表达;RT-PCR方法检测炎症因子IL-1β、TNF-α的mRNA表达.8.心脏组织自噬的检测:采用免疫荧光共定位法及RT-PCR方法检测心脏组织中LC3的表达.9.巨噬细胞自噬的检测:采用免疫荧光共定位法激光共聚焦显微镜观察F4/80与LC3共定位,MitoTraker与LC3共定位.Western Blot蛋白免疫印记法检测巨噬细胞LC3Ⅱ/Ⅰ表达及定量.透射电镜观察巨噬细胞自噬超微结构.10.线粒体产生ROS检测:MitoSOX直接标记线粒体特异性ROS的产生.流式细胞仪定量检测MitoSOX阳性细胞百分比.11.报告基因NF-κB激活:采用免疫荧光共定位法检测巨噬细胞P65入核情况.巨噬细胞转染NF-κB腺病毒(Ad.NF-κB-Luc)24小时,加入荧光素底物,用经诺真活体成像系统采集检测NF-κB的活性.12.心脏组织纤维化测定:采用Masson三色特殊染色方法检测组织内胶原沉积.采用免疫组织化学染色方法检测Ⅰ型胶原、α-SMA及TGF-β的表达.13.成纤维细胞分化的检测:采用巨噬细胞和成纤维细胞共培养,通过免疫荧光和RT-PCR方法检测Ⅰ型胶原、α-SMA及TGF-β的表达.14.统计学分析:所有数据都以平均值±标准差表示.组间均数比较采用one-way ANOVA;P＜0.05认为差异有统计学意义.
结果：1.血管紧张素Ⅱ灌注野生小鼠血压显著高于生理盐水灌注,与相应Atg5杂合鼠无差异.2.血管紧张素Ⅱ灌注野生小鼠心功能与Atg5杂合鼠无差异.3.血管紧张素Ⅱ灌注野生小鼠后心脏组织表达Atg5增加,而血管紧张素Ⅱ灌注Atg5杂合鼠后Atg5表达较野生小鼠降低.4.血管紧张素Ⅱ刺激下,巨噬细胞中Atg5表达较心肌细胞,成纤维细胞差异明显.5.Atg5表达降低加重血管紧张素Ⅱ诱导的炎症细胞浸润,使Mac-2、IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平均显著升高.6.Atg5表达降低导致血管紧张素Ⅱ诱导的心脏组织自噬降低.7.Atg5表达降低导致血管紧张素Ⅱ诱导的巨噬细胞自噬及线粒体自噬降低.8.Atg5表达降低促进血管紧张素Ⅱ诱导的巨噬细胞线粒体ROS产生增加.9.Atg5表达降低促进血管紧张素Ⅱ诱导的巨噬细胞NF-κB激活.10.Atg5表达降低加重血管紧张素Ⅱ诱导的心脏纤维化.11.Atg5表达降低促进血管紧张素Ⅱ诱导的成纤维细胞的分化.
结论：1.Atg5表达降低促进血管紧张素Ⅱ灌注导致的心脏炎症反应和纤维化.2.Atg5表达降低导致血管紧张素Ⅱ诱导的巨噬细胞线粒体自噬异常,ROS累积增加,激活NF-κB,促进炎症反应.