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目的:探索非牙源性上皮干细胞体外长期扩增的上皮细胞的培养方法,为将来进行细胞重组牙再生提供种子细胞来源.
方法:获取临床手术得到的正常牙龈组织，剪成1cm×1cm大小的组织块，4mg/mlDiseaseⅡ 37℃消化约20min，体视镜下用分离上皮和间充质，将上皮置于0.25％胰蛋白酶中，37℃消化约15min,终止消化，吹打成单细胞，离心弃上清后，改良上皮培养基重悬细胞，接种于含有3T3伺养层细胞(已经5μg/m(丝裂霉素C处理3小时)的培养皿共同培养，上皮和饲养层细胞的接种比为1:5-10，在37℃含有5% C02的培养箱培养。改良培养基的成分:F培养基(DMfD/F12培养基、5%FBS. 5mg/ml胰岛素、5mg/m(转铁蛋白、2×10-10M三碘甲状腺氨酸、1×10-10M霍乱毒素、0.5mg/ml氢化可的松和0.1mg/mt表皮生长因子)+ROCK抑制剂Y27632(10μM)+添加青霉素(1000unitjml)+链霉素(1mg/ml),当细胞长满后，胰蛋白酶差数消化上皮细胞进行传代继续培养.利用倒置显微镜观察细胞生长情况，绘制细胞生长曲线，CCK-8法观察细胞增殖特征，免疫荧光染色法鉴定细胞。
结果:培养3天后原代上皮细胞呈立方形或多角形形成多个克隆。细胞生长迅速，5天后多个克隆融合，并呈铺路石样排列。上皮细胞可连续传代。传代的细胞经3-5天可达到80%-90%融合，上皮细胞仍保持铺路石样排列，上皮细胞周围的饲养层细胞被挤成条索状并逐渐减少。细胞生长曲线和CCK-8法显示细胞生长呈指数扩增。免疫荧光染色显示上皮细胞CK14和LGRS表达阳性.连续IO代传代培养表明细胞依旧保持良好的生长状态，表面杨己无明显改变。
结论:采用改良培养基培养非牙源性上皮细胞，可以有效改善上皮细胞的贴壁速度，ROCK抑制剂Y27632可以促进上皮的生长，连续传代培养表明上皮细胞形态和干性没有发生改变。该改良上皮培养法可潜在用于细胞重组牙再生的种子细胞的大量体外扩增.