CRISPR/Cas9 技术是在细胞系中进行基因敲除的新方法，具有简便、快速和高效的优点，在基因功能研究中具有广泛的应用前景。核糖核酸酶在RNA 的加工、生成、代谢和生物学功能发挥中具有重要作用，目前对大多数的RNase 的生物学功能的多样性和调控机制了解甚少。我们利用CRISPR/Cas9 技术，根据GenBank 中RNase L 和Drosha基因序列，分别设计RNase L 和drosha 敲除的sgRNA 序列，并分别将其克隆到pCas-Guide 真核表达载体中，获得pCas-gRNA 载体；设计供体 DNA 的同源臂序列，通过搭桥PCR 将左同源臂、潮霉素B 抗性基因和右同源臂扩增成为一条片段作为同源重组的修复模板，并将其克隆到pBackZero-T 表达载体上。将上述两个载体共转染HEK293 细胞，用潮霉素B 筛选，通过western blot 和DNA 测序等技术验证结果表明RNase L 和Drosha 分别被从基因组上敲除。成功获得了RNase L 缺失的细胞株和Drosha缺失细胞株，为探讨RNase L 和Drosha 的生物学功能和研究其作用的分子机制奠定了基础。