【摘 要】
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本文报道了用地高辛标记工程菌DNA片段作探针,通过分子杂交和免疫显色检测基因工程制品重组人血小板源生长因子(Recombinant Human Platelet Derived Growth Factor,r-hPDGF)
【机 构】
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北京金赛狮生物制药技术开发有限责任公司(北京)
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本文报道了用地高辛标记工程菌DNA片段作探针,通过分子杂交和免疫显色检测基因工程制品重组人血小板源生长因子(Recombinant Human Platelet Derived Growth Factor,r-hPDGF)半成品中残余DNA的方法.用玻璃珠法提取、纯化酵母工程菌的总DNA,四碱基酶酶切裂解DNA片段后,用地高辛标记作为探针,探测r-hPDGF半成品中的DNA含量.酵母菌属于真核生物,基因组DNA分子量较大肠杆菌的基因组大许多,为避免作为正对照的模板和探针在杂交过程中因两者长度间差异过大而导致的测定误差,有必要用四碱基酶将工程菌总DNA片段也随机切成短片段,保证正对照结果的准确性.为进一步验证酶切的必要性,我们提取了E.coli的总DNA,直接进行探针标记后,再与其自身的模板杂交,其间无需酶切或超声破碎,显色灵敏度可达10pg.而同样的方法,用在酵母染色体上,杂交后显色很不理想,因此对较大的染色体DNA进行适当的处理是十分必要的.被检测样品用蛋白酶K溶液对其处理,37℃,4小时,从而消除蛋白含量对DNA检测的干扰.检测结果表明,3批r-hPDGF样品均符合WHO的要求,每剂量半成品的外源DNA含量均低于100pg,该方法的敏感性为100pg.
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