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5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)可能与特定肿瘤的发生密切相关,有可能成为肿瘤早期诊断的生物标志物.本研究采用引物延伸和T4 DNA连接酶连接反应合成了含有修饰位点5hmC的ds100mer DNA探针。根据Carnelley等人合成双链探针中含有修饰位点的一段，主要采用引物延伸方法。其中根据所选底物的不同，合成的修饰位点包括胞嘧啶(C)、5mC和5hmC。为了获得较高的引物延伸效率，实验中对延伸过程中的底物浓度配比、DNA聚合酶种类、引物浓度和延伸时间等条件进行了考察，在最适条件下，凝胶电泳图显示延伸后的结果有3个主要条带，根据与模板和引物条带之间的对照，可以确定各条带从上到下依次是:过量未反应的模板(41 nt)、延伸产物oligo(1)(26 nt)和过量未反应引物(20 nt)。然后，在T4 DNA连接酶作用下，将5hmC-oligo(1)与其他5条oligos进行连接，生成完整的双链结构，即双链中的一条链含有5hmC。连接过程中，oligo(5)作为oligo(1)的互补链协助oligo(1)、oligo(2)和oligo(3)的连接，此种设计有利于双链DNA探针的PAGE纯化。