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目的：复制小鼠下腔静脉-颈总动脉移植(vein graft)模型,构建靶向Egr-1基因RNAi慢病毒载体,采用病理学及分子生物学技术观察静脉桥血管再狭窄程度,Egr-1、ICAM-1表达,Egr-1与ICAM-1启动子区结合活性,探究Egr-1在机械牵张力作用下对ICAM-1的调节作用,阐明转录因子Egr-1在静脉桥血管再狭窄过程中的作用.
方法：1.研究对象分组实验组为16只雄性Egr-1基因敲除小鼠,对照组为20只雄性C57BL/6小鼠,雄性Egr-1基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠各5只分到假手术组.2.复制动物模型参照"套袖法"复制小鼠vein graft模型.术后2周处死小鼠,收取静脉桥血管.3.构建靶向人Egr-1基因RNAi慢病毒载体设计并合成1条Egr-1过表达序列和4条干扰序列,过表达序列与双酶切Ubi-MCS-3FLAG载体连接,干扰序列与双酶切hU6-MCS-CMV-EGFP连接,DNA测序鉴定重组载体.共转染人脐静脉内皮细胞后(分组:OE-RNAi-1,OE-RNAi-2,OE-RNAi-3,OE-RNAi-4)Western-blot 检测Egr-1蛋白表达,筛选有效干扰靶点,RT-PCR检测Egr-1 mRNA,验证干扰效果.4.标本采集及处理方法:Vein graft术后2周收取静脉桥血管,置于10％中性福尔马林中保存.HE染色观察静脉桥血管管腔形态学变化,免疫组化技术定性定位检测Egr-1、ICAM-1蛋白表达情况5.细胞培养及处理方法:分别培养正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和Egr-1RNAi慢病毒载体感染HUVEC(即Egr-1减表达HUVEC),置于细胞拉力仪上进行机械牵张刺激,Brdu法检测增殖活性,real-time PCR检测Egr-1、ICAM-1 mRNA表达,Western-blots检测其蛋白表达.6.启动子结合活性检测:分别构建Egr-1和ICAM-1启动子过表达载体,根据分组(CON: Egr-1和空载体质粒,EXP1:Egr-1和ICAM-1启动子质粒,EXP2:Egr-1和ICAM-1启动子突变质粒)转染293T细胞后,用luciferase检测荧光强度,判断Egr-1与ICAM-1启动子结合活性.
结果：1.成功构建小鼠下腔静脉-颈总动脉移植(vein graft)模型;2.成功构建Egr-1 RNAi慢病毒载体,并找到一个最有效的抑制靶点;3.与假手术组相比,实验组及对照组静脉桥血管管腔均发生狭窄(P＜0.05);与对照组相比,实验组静脉桥血管管腔狭窄程度明显减轻(P＜0.05);4.与对照组相比,实验组静脉桥血管内皮细胞ICAM-1表达明显减少(P＜0.05);5.与正常HUVEC相比,Egr-1减表达HUVEC受到机械刺激后增殖活性明显降低(P＜0.05);6.内皮细胞受到机械牵张刺激后,Egr-1及ICAM-1蛋白及mRNA表达明显增加,Egr-1敲减可抑制ICAM-1表达(P＜0.05);7.Luciferase检测发现,EXP1和EXP2组荧光强度均明显高于CON组(P＜0.05),EXP1组荧光强度明显高于EXP2组(P＜0.05)。
结论：1.机械牵张是导致静脉桥血管再狭窄的重要因素2.机械牵张可以促进静脉内皮细胞增殖及Egr-1、ICAM-1表达3.Egr-1可通过直接调控ICAM-1表达,加重血管炎症反应,导致静脉桥血管再狭窄.