【研究背景】由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病(Verticillium Wilt of cotton)是一种土传维管束病害,严重威胁着棉花产量和棉纤维质量,被称为"棉花癌症"。大丽轮枝菌基因组信息的发布及寄主诱导的基因沉默(Host-Induced Gene Silencing,HIGS)等技术的快速发展,极大地促进了病原菌致病关键基因的分离、鉴定和功能分析,为培育高抗黄萎病的棉花新品种提供了更为丰富的基因资源。【材料方法】本研究建立了一套针对高致病力大丽轮枝菌菌株V991的HIGS体系,用于大规模筛选病原菌致病和生长发育的关键基因。采用同源替换技术将病原菌候选基因进行敲除,深入研究其生物学功能;构建针对候选基因的RNAi(RNAinterference)质粒并转化植物,通过表型分析和分子生物学手段评估转基因植物的抗性水平。【结果与分析】利用此体系,已构建126个含有靶标基因的HIGS质粒,病原菌体内的靶标基因被沉默后,植株的病情指数显著降低,从中筛选获得20个与病原菌致病力密切相关的基因。这些基因主要参与了大丽轮枝菌糖代谢、碳代谢、能量代谢和蛋白质代谢等多个代谢途径。对其中部分基因的生物学功能进行深入研究,发现:寡糖基转移酶STT3亚基基因涉及糖代谢通路,在孢子萌发过程中发挥重要作用,将其敲除突变后,与野生型和回补体相比,突变体碳源吸收利用能力、菌丝体发育、产孢能力和糖蛋白的分泌能力受到了明显抑制,从而导致孢子在根部的萌发能力以及致病力显著下降;ADP-ATP载体蛋白(AAC)基因是病原菌能量代谢过程中的关键酶,将其敲除突变后,引起与能量代谢相关的基因的表达明显提高,突变体孢子的萌发能力、抗逆能力以及致病力显著低于野生型和回补体。随后,针对这些基因构建了RNAi干扰质粒并转化烟草,获得的转基因植物病情指数以及真菌生物量显著下降,明显提高了对大丽轮枝菌的抗性。目前已将上述质粒转化棉花,进行进一步的抗病性验证。【结论】本研究建立的HIGS体系,可以更加直接观察植株与真菌互作和快速的筛选致病关键基因;AAC和STT3基因可作为潜在的候选基因,培育高抗黄萎病的转基因棉花。