【摘 要】
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热休克蛋白60(Hsp60)在病原性及保护性的免疫应答过程中起关键作用,并且参与自身免疫疾病.为了深入了解该基因在拟穴青蟹(Scylla paramamosain)中的免疫防御机制,本实验应用RACE技术获得了SpHsp60基因；通过原位杂交技术检测该基因在三种血细胞中的定位；利用实时荧光定量PCR技术,选定三个管家基因(β-actin,18S rRNA和GAPDH)作为内参来研究细菌、渗透压、高
【机 构】
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厦门大学海洋与地球学院,福建厦门361005
【出 处】
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2012年全国博生研究生学术论坛——可持续的水产养殖：理论与实践
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热休克蛋白60(Hsp60)在病原性及保护性的免疫应答过程中起关键作用,并且参与自身免疫疾病.为了深入了解该基因在拟穴青蟹(Scylla paramamosain)中的免疫防御机制,本实验应用RACE技术获得了SpHsp60基因；通过原位杂交技术检测该基因在三种血细胞中的定位；利用实时荧光定量PCR技术,选定三个管家基因(β-actin,18S rRNA和GAPDH)作为内参来研究细菌、渗透压、高温刺激后血细胞中SpHsp60表达量.实验结果表明：克隆获得的SpHsp60的cDNA全长为2424 bp.预测的开放阅读框编码一个由576个氨基酸组成的蛋白,分子量为61.19kDa,理论等电点5.46.Blast比对后与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)具有95％的一致性.原位杂交分析表明,血淋巴中SpHsp60主要分布于颗粒细胞和半颗粒细胞中.溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)刺激后,血细胞中SpHsp60的表达量在96 h内具有明显的时间依赖性.在整个实验中,该基因的表达被诱导并且在3h出现最大值.SpHsp60的这种上调表达及快速应答现象说明拟穴青蟹对细菌刺激非常敏感.渗透压变化后,血细胞中该基因的表达能够被高盐(30‰)诱导以利于拟穴青蟹对高盐环境的适应.不同温度刺激后6h分析血细胞中SpHsp60表达,最高和最低表达量分别在36℃和32℃.这一现象表明高温对宿主细胞表现出胁迫性,SpHsp60表达容易被高温所诱导并且对温度变化敏感.整个实验结果提示,SpHsp60表达可以被细菌、渗透压、温度胁迫所诱导,并且可能在拟穴青蟹的先天性免疫应答中扮演重要角色.
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