建立室间隔缺损患者特异性iPS细胞系并高效分化为心肌细胞

来源 :中华医学会第十八次全国儿科学术会议 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xtepnui2020
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目的:将室间隔缺损患者胸腺组织细胞重编程为诱导性多能干细胞(iPSCs)并高效分化为心肌细胞.方法:①利用反转录病毒将四个干细胞基因Sox2、Klf4、Oct4和Nanog导入人胸腺组织细胞,重编程为多潜能干细胞.②设计实验对获得的iPS细胞进行形态及功能学鉴定,同时进行核型分析以及短串联重复序列(STR)检测.③采用两步法将我们获得的iPS细胞向心肌细胞诱导分化,并人为干预分化过程.贴壁培养第4天在基础培养基(RPMI1640培养液+B27,1X)中添加25ng/ml BMP4和6ng/ml bFGF,第5天换成100ng/ml activin A,从第6天开始添加250ng/mlNoggin连续处理5天,5天后换成200ng/ml DKK1连续处理8天,隔天换液一次,观察到有自发节律收缩的心肌样细胞出现后,改用基础培养基继续培养.④通过免疫组化技术及RT-PCR方法等对分化细胞进行鉴定;利用流式细胞仪计算心肌细胞分化率.结果:①iPS细胞形态学特点及功能鉴定:iPS细胞镜下观察呈典型人ES细胞样克隆生长;RT-PCR,碱性磷酸酶染色及免疫荧光检测iPS细胞高表达胚胎干细胞相关基因及蛋白,体内外实验能向三胚层分化;经STR分析证实无交叉污染。OiPS细胞向心肌细胞的分化:EBs贴壁培养4天,相差显微镜下即可见在EBs生长晕中出现自发节律性收缩细胞团;搏动细胞团分离出的单个细胞用Real-Time PCR检测到能表达心肌细胞相关基因,免疫染色检测能表达心肌特异的marker;流式细胞仪计算心肌细胞分化率达70%.结论:成功建立了室间隔缺损患者特异性iPS细胞系,并找到了一种将人iPS细胞高效分化为心肌细胞的实验方法。
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