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目的:采用过氧化氢(H2O2)和叔丁基过氧化氢(tBOOH)为活性氧诱导剂,研究鸡枞多糖对活性氧激活的小鼠腹腔巨噬细胞相关酶活性和NO释放的影响,进一步揭示鸡枞多糖对巨噬细胞的免疫调节机制.
方法:7~10周龄雄性BALB/c小鼠,脱颈处死,从腹腔中获取巨噬细胞,采用"差速粘附法"纯化巨噬细胞.细胞分为阴性对照组,阳性对照组和不同剂量给药组,各设3个重复孔.药物终浓度分别为10、100、500μg·mL-1,置37℃、5%CO2孵箱内培养24h后,分别加入终浓度为0.2mmol·L-1H2O2或tBOOH再孵育24h,刺激和损伤小鼠腹腔巨噬细胞.阴性对照组以15%FBS RPM11640培养液代替(无多糖和H2O2、tBOOH),阳性对照组含终浓度为0.2mmol·L-1H2O2或tBOOH.细胞终止培养后,吸上清冻存,用于NO、LDH等生化指标的测定.余下的细胞中加入200μl细胞裂解液反复冻融三次,37℃过夜。次日收集细胞裂解液,4℃12000r/min离心25min,吸取上清备用,用于GSH、SOD等指标的测定。采用MTT法检测鸡枞多糖对小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响,与对照组比较,判断药物对小鼠腹腔巨噬细胞生长的影响。采用Griess分析法测定一氧化氮的量。乳酸脱氢酶(LDH)、还原型谷肤甘肤(GSH)、超氧化物歧化酶((SOD)等测定用南京建成生物工程研究所试剂盒。
结果:(1)鸡枞多糖可显著抑制H202和tBOOH诱导的巨噬细胞存活率下降和LDH的露出,并且具有剂量依赖性。(2)鸡枞多糖可显著抑制H202和tBOOH诱导的巨噬细胞GSH含量和SOD活性的下降。(3)鸡枞多糖对H2O2和tBOOH引起的NO释放方面显示出“低浓度促进,高浓度抑制”的特性。
结论:鸡枞多糖能不同程度地抑制H202或tBOOH诱导巨噬细胞存活率下降和LDH的释放率,表明该多糖有抗氧化损伤的作用。鸡枞多糖对H202和tBOOH激活巨噬细胞释放NO有明显的调控作用。即在NO浓度较低时,激活巨噬细胞释放NO,起到杀伤多种病原体及肿瘤细胞的作用;但在NO浓度较高时,抑制巨噬细胞释放NO,以防NO的过多释放而对宿主细胞产生细胞毒作用。鸡枞多糖可提高激活的巨噬细胞GSH含量和SOD酶活性,起到保护细胞免受H202和tBOOH活性氧损伤的作用。鸡枞多糖促进NO释放的同时伴有GSH和SOD的消耗,提示细胞内GSH和SOD可能起到调节巨噬细胞NO生成和保护宿主细胞免受NO介导的细胞毒作用。