论文部分内容阅读
目的：同源盒基因hoxb4在促进造血发育方面有重要作用,已有的研究提示cdh5可能是hoxb4的下游靶基因,共同参与了造血发育的调控.本研究欲探讨在hoxb4过表达时cdh5对造血发育的作用,以揭示cdh5参与hoxb4调控造血发育的机制.方法：分别收集实验组(Tg zLmo2:LDL-Hoxb4-egfpxTg zLmo2:Cre)和对照组(Tg zLmo2:LDL-egfpx Tg zLmo2:Cre)转基因斑马鱼24hpf、30hpf的胚胎,将其制备为单细胞悬液,用流式细胞仪分选表达绿色荧光蛋白标记的成血成血管共同前体细胞;提取各组标本总RNA,并逆转录成cDNA,用实时荧光定量PCR的方法检测各标本中cdh5基因的mRNA表达量并比较分析其差异.构建带egfp报告基因的cdh5全长表达质粒并测试其能否工作;利用SP6体外转录系统分别获得cdh5和egfp的加帽mRNA,将该mRNA分别显微注射入野生型斑马鱼单细胞期胚胎后,收集3.75hpf、6hpf、9hpf、18hpf、24hpf、30hpf、36hpf、48hpf和72hpf的有绿色荧光蛋白表达的cdh5过表达组、egfp对照组及空白组胚胎,提取各组标本的总RNA,并逆转录制备cDNA,经实时荧光定量PCR检测sc/、Imo2、c-myb和runx1的mRNA表达量.结果：经实时荧光定量PCR的方法检测后发现:hoxb4实验组cdh5基因mRNA的表达量在24hpf和30hpf均较egfp对照组明显升高，有统计学意义(p<0.05)。构建了cdh5-egfp-pCS2+重组质粒，经显微注射有绿色荧光蛋白表达;经sp6体外转录出了cdh5-egfp和egfp的加帽mRNA;两种mRNA经显微注射后均可以观察到绿色荧光的表达。过表达cdh5的胚胎原始造血转录因子scl在6hpf,9hpf,18hpf,24hpf,30hpf,Imo2在3.75hpf,6hpf,9hpf 18hpf,24hpf,30hpf时均较egfp组和空白组明显升高，有统计学意义(p<0.05);成体造血转录因子c-myb在3.75hpf,6hpf,9hpf 18hpf,24hpf,30hpf,runx1 6hpf,9hpf 18hpf,24hpf,30hpf时均较egfp组和空白组明显升高，有统计学意义(P<0.05)。结论：hoxb4过表达转基因斑马鱼胚胎期造血组织中cdh5的表达量明显升高。在野生型斑马鱼胚胎中过表达cdh5时可以引起原始造血增强;早期阶段的成体造血也明显增强acdh5基因可能是hoxb4基因的下游靶基因，共同参与了胚胎早期阶段hoxb4对造血发育的调控过程。