【摘 要】
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银杏(Ginkgo biloba L.)类黄酮具有重要的药用价值,.类黄酮在植物体内的积累水平主要由参与其合成的多个酶蛋白的活性所决定,而这些相关酶的表达受到相应的转录因子调节.转录因子通过激活类黄酮等次生代谢途径中多个酶基因的表达,可有效地启动或关闭次生代谢合成途径,从而调节特定次生代谢物的形成,因此转录因子的基因工程是类黄酮代谢遗传改良的有效策略.MYB 类转录因子广泛参与苯丙氨酸途径中类黄酮
【机 构】
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长江大学园艺园林学院,湖北 荆州 434025 黄冈师范学院 经济林木种质改良与资源综合利用湖北省
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银杏(Ginkgo biloba L.)类黄酮具有重要的药用价值,.类黄酮在植物体内的积累水平主要由参与其合成的多个酶蛋白的活性所决定,而这些相关酶的表达受到相应的转录因子调节.转录因子通过激活类黄酮等次生代谢途径中多个酶基因的表达,可有效地启动或关闭次生代谢合成途径,从而调节特定次生代谢物的形成,因此转录因子的基因工程是类黄酮代谢遗传改良的有效策略.MYB 类转录因子广泛参与苯丙氨酸途径中类黄酮化合物和木质素的生物合成,尤其是R2R3-MYB 转录因子在类黄酮代谢途径中起着关键的作用.本研究从银杏中克隆得到了黄酮醇合成中的转录因子基因GbMYBF2,并对其序列特征、基因性质及表达模式等进行了分析研究,具体内容如下：(1) 根据已知GbMYBF2 基因的cDNA 片段序列设计特异性引物,利用RACE 技术克隆GbMYBF2 的cDNA 全长序列,再以GbMYBF2 的cDNA 全长扩增该基因的DNA 全长(GenBank 登录号为JQ068807).GbMYBF2 基因的cDNA 全长为1370bp,包含一个poly(A)尾巴和一个1041bp 的开放阅读框,编码346 个氨基酸.GbMYBF2 基因的基因组序列含有三个外显子和两个内含子,外显子的大小分别为133bp、130bp 和778bp,内含子片段的大小分别是143bp 和123bp.GbMYBF2 蛋白分子量大小为38.9 kD,等电点是pI 4.86.经NCBI 中的BLASTP 比对分析表明：GbMYBF2 蛋白的氨基酸序列与其它植物MYB基因编码的氨基酸序列高度同源.在GbMYBF2 蛋白的R3 区域中,包含一个[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R基序,该基序可以与类似于R 区域的例如bHLH 蛋白相互作用,表明这个特殊的R 区域类似bHLH 辅助因子和其它的MYB 转录因子一样作为代谢过程的调节因子.在GbMYBF2 蛋白的碳末端也具有两个保守的基序LIsrGIDPxT/SHRxI/L 和pdLNLD/ELxiG/S,研究指出这两个基序作为抑制类黄酮生物合成相关基因的转录阻遏物.该蛋白的二级结构类型包括α-螺旋(Alpha helix)约占34.39％；延伸链(Extended strand)约占5.49％；β-转角(Beta turn)约占3.47％；无规则卷曲(Random coil)约占56.65％.系统进化树结果表明：GbMYBF2 与在类黄酮化合物代谢过程中具有抑制作用的转录因子关系相近.Southern blot 的结果表明在银杏中GbMYBF2 基因只有一个拷贝.(2) 利用Real-time PCR 技术分析了GbMYBF2 基因在银杏叶不同生命时期的表达水平与银杏叶中类黄酮化合物含量的关系.结果表明银杏叶不同生命时期中,GbMYBF2 基因的表达水平与叶片中积累的类黄酮含量呈负相关.(3) 利用Real-time PCR 技术分析了GbMYBF2 基因过表达对拟南芥体内类黄酮合成代谢中的关键酶基因PAL、FLS、CHS、F3H、CHI 和ANS 表达水平的影响.结果表明GbMYBF2 基因过量表达,对上述基因的表达均有不同程度的抑制作用,其中对PAL 基因表达水平的影响最大,抑制作用最强的时候,可使PAL基因的表达量降低17 倍；对CHI 基因表达水平的的影响较小,其中在二月份和六月份左右,GbMYBF2基因过量表达甚至会促进CHI 基因的表达.使用HPLC 方法分析转基因拟南芥中GbMYBF2 基因表达水平与类黄酮含量的关系,检测结果表明GbMYBF2 的过量表达能够阻碍黄酮类化合物的合成,使植物体内黄酮类化合物的含量较正常值低.
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