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目的:研究hsa-miR-145真核表达载体在人正常睾丸细胞hs 1.tes细胞中对于SOX9基因表达差异的影响;研究hsa-miR-145对睾丸生殖细胞肿瘤(人恶性多发性畸胎瘤细胞)NTERA-2细胞系的增殖与凋亡影响。
方法:1.hsa-miR-145表达质粒构建与鉴定;2.用qRT-PCR和Western免疫印迹技检验hs 1.tes细胞中SOX9的表达差异;3.MTT法用于检测hsa-miR-145对NTERA-2细胞增殖的影响,流式细胞术检测NTERA-2细胞凋亡,qRT-PCR法检测OCT4、SOX2、c-Myc、KLF4、FSCN1在转录水平的表达差异。
结果:1.通过qRT-PCR实验证实,hs 1.tes细胞和NTERA-2细胞转染pGenesil-1-miR-145后,可以有效的上调细胞中hsa-miR-145的表达;2.qRT-PCR实验检测结果显示,在hs 1.tes细胞中高表达的hsa-miR-145可以使SOX9的mRNA水平降低,western bolt实验结果显示,上调hsa-miR-145后,SOX9蛋白表达水平也降低,这说明hsa-miR-145在转录和翻译水平同时抑制SOX9基因表达;3.NTERA-2细胞中,hsa-miR-145的过表达可以导致细胞增殖的抑制,并且促进细胞凋亡,NTERA-2细胞中的qRT-PCR结果表明,其可以抑制与肿瘤相关的OCT4、SOX2、c-Myc和FSCN1基因的表达。
结论:本实验成功构建了pGenesil-l-miR-145和pGenesil-l-miR-NC重组体,转染两种细胞后可以使hsa-miR-145在细胞中有效的表达。在hs 1.tes细胞中,hsa-miR-145可以在转录和翻译水平上抑制SOX9的表达。在NTERA-2细胞中hsa-miR-145的升高,可以通过抑制靶基因的表达,影响生殖肿瘤细胞的生物学功能。