里氏木霉(Trichoderma reesei)作为纤维素酶工业中主要的生产菌株,在分泌能力方面有着巨大的优势。我们在前期以诱变、实验室驯化等手段获得一株胞外分泌能力强的高产菌株,并以此作为高效分泌表达的真核底盘细胞。首先,我们利用双向选择标记构建了marker-free系统,实现了多基因表达和敲除。为了提高异源蛋白的效率,还优化了cbh1启动子,将位于启动子上的阻遏因子结合位点突变为激活因子结合位点。为了探究该分泌表达系统的特点,课题组选取了同为真核的商品化毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达系统作为参考,以真菌来源的Bg1S作为外源蛋白,通过测定Bg1S的特性研究该系统的修饰特性。在T.reesei中,除了N224位点,其他三个仅被一个G1cNAc修饰。Trichoderma reesei的适度修饰使Bg1S在分泌量、酶活、稳定性及其与底物的亲和力等方面比毕赤酵母表达系统更具有优势。利用这一表达系统,结合异源表达的一系列优化手段,如融合基因、密码子优化、同源替换等,获得了一系列高产菌株。对这些高产菌株进行进一步的遗传操作,对其进行转录激活因子的过表达,阻遏因子的敲除,有效提高了目标蛋白的产量。这些工程菌株在小瓶发酵体系的酶活已和一些商品化酶制剂酶活相当。