【摘 要】
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本研究旨在通过构建过表达质粒,在体外实验中探讨APPC31的毒性作用及其可能的机制,期望为进一步探讨阿尔茨海默病(Azleimer,s disease,AD)的发病机制和治疗方法提供理论
【机 构】
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上海交通大学医学院附属瑞金医院神经内科,上海200025
【出 处】
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中国神经科学学会第九届全国学术会议暨第五届会员代表大会
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本研究旨在通过构建过表达质粒,在体外实验中探讨APPC31的毒性作用及其可能的机制,期望为进一步探讨阿尔茨海默病(Azleimer,s disease,AD)的发病机制和治疗方法提供理论和实验依据.采用分子克隆实验方法构建pIRES2-EGFP-APPC31、pEGFP-C2-APP△C31真核过表达质粒.采用LipofectamineTM2000转染试剂盒将过表达的空载体质粒、野生型APP695质粒、APP(D664A)质粒、APP氨基端长肽(APP△C31)质粒和APPC31质粒瞬时转染Neuro2a细胞.采用免疫荧光方法检测质粒成功转入细胞并表达目的蛋白.采用MTT比色法检测不同浓度Aβ42作用24 h后的Neuro2A细胞活力；及质粒APPC31转染入Neuro2A细胞48 h的细胞活力；及瞬时转染各组质粒24 h后与Aβ42(10 μM)共孵育24 h的Neuro2A细胞活力.采用Western blotting检测Aβ42(10μM)作用Neuro2A后对Tau蛋白磷酸化水平的影响,及瞬时转染各组质粒后与Aβ42共孵育时Tau蛋白磷酸化水平的变化.用GSK3β抑制剂LiCl分别处理,转染野生型APP695质粒及APPC31质粒后与Aβ42(10 μM)共孵育的细胞,采用Western blotting检测其Tau蛋白磷酸化水平的变化.结果发现在无Aβ42共孵育时,空载体质粒转染组和APPC31质粒转染组细胞活力无明显差异(P＞0.05)；Aβ42(10 μM)共孵育条件下,无转染组、空载体质粒组、野生型APP695质粒组、APP(D664A)质粒组和APPC31质粒组细胞活力与空载体质粒组对比,野生型APP695质粒组及APPC31质粒组细胞活力明显下降(P＜0.05)；Aβ42所致Tau蛋白在第396、199位点的磷酸化呈时间依赖性,在12h时磷酸化水平最高；Aβ42致APP、APPC31过表达细胞中Tau蛋白在第396位点的磷酸化水平显著升高(P＜0.05)同时这种磷酸化水平被GSK-3β抑制剂LiCl显著抑制(P＜0.05),提示在野生型APP及APPC31过表达的Neuro2A细胞中,GSK-3β参与了这种Tau蛋白396位点磷酸化水平的升高.综上可见,体外Neuro2a细胞中单独过表达一定水平的APPC31并不能致细胞毒性作用；但此短肽可通过GSK-3β诱导的Tau蛋白过磷酸化来增强Aβ42致细胞毒性作用.本研究为进一步明确其发病机制提供了一定的实验依据.
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