【摘 要】
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[目的]瘦素为诱导剂构建体外离体睾丸Leydig细胞(TM3细胞)模型,为肥胖对雄性生殖影响的机制研究提供参考.[方法]取对数生长期TM3细胞以3.5×104/mL密度接种于96孔板上,共
【出 处】
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中国毒理学会第七次全国毒理学大会暨第八届湖北科技论坛
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[目的]瘦素为诱导剂构建体外离体睾丸Leydig细胞(TM3细胞)模型,为肥胖对雄性生殖影响的机制研究提供参考.[方法]取对数生长期TM3细胞以3.5×104/mL密度接种于96孔板上,共设4组,分别为瘦素2.5 μg/ml剂量组、5 μg/ml剂量组、10μg/ml剂量组及对照组,每组4孔,于37℃、5％CO2培养箱中培养24h后,去除培养液,每孔加入不同浓度药物100μL作用4h,然后每孔加入20 μL 5g/L的MTT,温育4h,去除培养液及MTT,每孔加入150μL二甲基亚砜,用酶标仪测定各孔在波长492nm处的吸光度,计算细胞存活率.按照MTT法分组加药4小时后取细泡培养液,加入类固醇取代试剂及抗体,室温下放在摇床上孵育1h,孵育后每孔内加入50 μl Blue Conjugate,继续室温孵育1h,清空96孔板,洗3次,充分吸干板内液体后向每孔内加入200 μl pNpp Substrate solution,37度孵育1h,在405nm处检测各孔的吸光度值,检测上清液中睾酮水平.取瘦素作用的细胞,超声以充分破碎细胞并释放其中的抗氧化物,4℃12000g离心5分钟,取上清液作为样本,参照ELISA法测定细胞内活性氧含量(ROS)、总抗氧化能力(TAOC)、SOD、H2O2酶(CAT)活性.[结果]不同浓度的瘦素作用于TM3细胞4h后,与对照组比较,2.5 μg/ml瘦素作用细胞存活率与正常对照组相比没有显著变化,5、10μg/ml瘦素组细胞存活率明显降低(P＜0.05).与对照组比较,5、10μ/ml瘦素组TM3细胞睾酮水平均明显降低(P＜0.05),呈剂量效应关系.与对照组比较,瘦素各剂量组TM3细胞TAOC明显降低(P＜0.05),5、10 μg/ml瘦素TM3组SOD、CAT活性均明显降低(P＜0.05)；与对照组比较,瘦素各组TM3细胞活性氧含量明显升高.[结论]成功构建以瘦素为激诱导剂的TM3细胞体外损伤模型.
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