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环氧水解酶(EC 3.3.2.3)能催化水分子立体选择性地加成到环氧底物上,生成相应的邻位二醇.此类水解酶普遍具有较好的位置选择性和对映选择性,因此成为动力学拆分消旋环氧化物制备手性环氧与二醇的理想催化剂.在前期研究中,我们克隆表达了来自Bacillus megaterium的环氧水解酶BmEH(Bacillus megaterium EpoxideHydrolase),对苯基缩水甘油醚(PGE)及其衍生物具有很高的活性及对映体选择性.然而对于具有较大取代取团的PGE衍生物,如经典降压药物普萘洛尔合成前体萘基缩水甘油醚的活性和选择性却处于较低水平.本研究利用X-ray晶体衍射的方法解析得到了BmEH分辨率为1.75 (A)的三维结构以及BmEH与底物类似物苯氧乙酰胺结合状态下的复合物结构(1.95 (A)).结构分析表明BmEH属α/β折叠类环氧水解酶,包含催化结构域和帽子结构域,位于两者之间活性中心由催化三联体Asp97、His267、Asp239和辅助底物结合与环氧开环的Tyr144、Tyr203等关键残基组成.与已知环氧水解酶结构相比,BmEH在活性口袋外侧具有疏水性底物预结合位点,活性口袋中保守的Trp98可与底物苯环形成π-π相互作用.分析亲核进攻残基Asp97与活性口袋相对位置表明BmEH具有与已知环氧水解酶结构相反的底物进入方向.结合复合物晶体结构及分子动力学模拟结果,我们确定了BmEH位于活性口袋底部的结构区域具有高度灵活性,由此推测BmEH活性口袋具有动态产物释放通道.总结BmEH催化机理为：环氧底物首先结合于酶蛋白表面的疏水区域,然后进入活性口袋完成环氧开环水解反应,最后产生的二醇通过动态产物释放通道被排出.据此催化机理在活性口袋周围选择了可能限制产物释放及底物结合空间的关键残基进行定点突变,其中M145A突变体对底物NGE相比于BmEH wildtype比活提高26倍.利用M145A粗酶液在两相反应(20％ v/v异丙醚)条件下对20 g/L萘基缩水甘油醚进行拆分,反应最终ees达99.3％,分离得率44％,产物二醇ee值89％,得率43％.