【摘 要】
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[目的]脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是一种常见的污染粮食、饲料和食品的真菌毒素,主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生.其毒性很强,可对人和动物发生多种毒性反应,严重危害着
【机 构】
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中国农业大学动物医学院 北京100193
【出 处】
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2013年中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十二次学术讨论会
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[目的]脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是一种常见的污染粮食、饲料和食品的真菌毒素,主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生.其毒性很强,可对人和动物发生多种毒性反应,严重危害着人畜健康,故有必要建立检测DON的分析方法.而免疫分析是当前广泛应用的检测技术.单链抗体(scFv)是上世纪80年代发展起来的一项抗体制备技术,通过一条连接肽将抗体轻、重链可变区基因连接起来,使得到的抗体分子量更小,制备周期更短,更具操作性.[方法]从杂交瘤细胞中提取RNA,根据Kabat和IMGT数据库设计全套引物,RT-PCR克隆获取抗体轻、重链可变区基因,以编码柔性多肽(Gly3 Ser)4的基因序列为接头,通过重叠延伸PCR技术,将轻、重链基因组装为完整的scFv基因,克隆入pJB33载体,转化大肠杆菌RV308,以0.25mM IPTG诱导表达,超声裂解法提取scFv,最后通过间接ELISA方法鉴定抗体活性.[结果]提取的RNA浓度约为794.2 ng/μL；轻连、重链、scFv基因大小约为320 bp、340 bp、750 bp,与文献报道相符.SDS-PAGE和Western Blotting结果显示所构建抗体是正确的.IC50值为165.22 ppb,检测范围50.49ppb--540.67ppb,R2 =0.9698.[结论]成功构建了抗DON的单链抗体,得到了其氨基酸序列,获得了稳定分泌抗DON单链抗体的大肠杆菌菌株,为下一步实验奠定了基础.
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