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目的：观察新生小鼠缺氧缺血脑损伤对大脑皮层、海马CA1区P-JNK、AIF及TUNEL阳性细胞表达的动态变化,探讨其相关性.研究基因敲除腺苷A2AR对新生小鼠缺氧缺血脑损伤神经细胞凋亡的影响,探讨其可能的分子机制.
方法：1、SPF级健康7日龄新生A2AR基因敲除(KO)小鼠32只及同窝野生型(WT)小鼠32只,分为KO组和WT组,每组下随机设假手术组(SKO、SWT,n=8),HIBD (Model)后分1d、3d、7d共3个时间点(M1dKO、M1dWT、M3dKO、M3dWT、M7dKO、M7dWT).按经典Rice-Vannucci法建立7日龄新生小鼠HIBD模型,S组分离左侧颈总动脉,不结扎；M组游离结扎左侧颈总动脉致脑缺氧缺血,2h后置于8％O 2 +92 ％N2环境中1h (37℃).动物造模后1d,采用三种发育反射(翻正反射、趋地反射和悬崖逃避反射)对小鼠进行短期神经功能评定,每组小鼠观察至规定时间经心脏灌注固定后光镜和TUNEL法观察新生小鼠大脑皮层和海马CA1区病理学改变及细胞凋亡情况,免疫组化法检测大脑皮层和海马CA1区AIF、p-JNK阳性细胞表达的动态变化.
结果：短期神经功能的评定：M组小鼠完成翻正反射(M1)、趋地反射(M2)和悬崖逃避反射(M3 )的时间分别都明显长于正常组(N)和假手术组(S)(P<0.01). MKO组完成上述反射的时间均长于MWT组(P<0.01,P<0.01,P<0.05)，各组差异有统计学意义。2.光镜下脑组织病理学改变：(1)HE染色：S组脑组织无水肿、坏死，大脑皮层和海马CA1区神经细胞排列整齐，边界清，形态正常；M组缺血侧大脑皮层及海马CA1区水肿，胞浆胞核空泡化，细胞核固缩，神经细胞数减少，以Mld组最明显，M3d组和M7d组有所减轻，与S组比较显著差异；MWT组脑组织损伤明显减轻，核固缩细胞减少。(2)尼氏染色：S组脑组织尼氏小体结构清晰，排列整齐，呈深蓝色斑块状，分布量多。M组缺血侧人脑皮层及海马CA1区尼氏小体大量丢失，排列稀疏，甚至尼氏小体出现溶解、空泡变性，Mld组最明显。而MWT组相对MKO组，损伤明显减轻，尼氏小体数量较多。3.TUNEL法检测神经细胞凋亡结果：M组缺血侧大脑皮层和海马CA1区TUNEL阳性细胞表达均于HIBD后1d达高峰，之后逐渐下降，各时间点均明显高于S组(P<0.01).MWT组在1 d, 3d, 7d各时间点TUNEL阳性细胞表达较MKO组明显降低(P<0.01).4.免疫组化检测结果：(1)AIF阳性细胞表达结果：正常大脑皮层和海马CA1区AIF阳性细胞少量表达，HIBD后1d达高峰，之后逐渐下降，各时间点AIF阳性细胞表达较S组明显升高(P<0.01).MWT组缺血侧大脑皮层在1d,3d,7d时间点AIF阳性细胞表达较MKO组明显降低(P<0.01,P<0.01,P<0.05)；MWT组缺血侧海马CA1区在1d, 3d,7d时间点AIF阳性细胞表达较MKO组明显降低(P<0.01,P<0.05,P<0.05).(2) P-JNK阳性细胞表达结果：正常大脑皮层和海马CA1区P-JNK蛋白极少量表达，HIBD后1d达高峰，之后逐渐下降，各时间点P-JNK阳性细胞表达较S组明显升高(P<0.01)。大脑皮层和海马CA1区MWT组1d,3d,7d时间点P-JNK阳性细胞表达较MKO组明显降低E(P<0.01,P<0.05,P>0.05).5.直线相关性分析：(1)KO组、WT组大脑皮层的神经细胞凋亡表达与P-JNK表达的平均吸光度值呈显著正相关(r=x.850,P<0.01).(2)KO组、WT组海马CA1区的神经细胞凋亡表达与P-JNK表达的平均吸光度值呈显著正相关(r=0.837,P<0.01).
结论：1.动物的神经行为学、组织病理学及TUNEL法检测神经细胞凋亡，表明成功制作了新生小鼠HIBD模型。2.腺昔Azn受体下调了缺氧缺血性脑损伤AIF和P-JNK的表达，减少了神经细胞的凋亡，从而拮抗缺氧缺血性脑损伤。3. AIF和P-JNK的动态表达变化及与神经细胞凋亡的相关性分析，提示腺昔Azn受体在缺氧缺血性脑损伤过程中的保护机制可能与抑制P-JNK的持续激活有关。
方法：1、SPF级健康7日龄新生A2AR基因敲除(KO)小鼠32只及同窝野生型(WT)小鼠32只,分为KO组和WT组,每组下随机设假手术组(SKO、SWT,n=8),HIBD (Model)后分1d、3d、7d共3个时间点(M1dKO、M1dWT、M3dKO、M3dWT、M7dKO、M7dWT).按经典Rice-Vannucci法建立7日龄新生小鼠HIBD模型,S组分离左侧颈总动脉,不结扎；M组游离结扎左侧颈总动脉致脑缺氧缺血,2h后置于8％O 2 +92 ％N2环境中1h (37℃).动物造模后1d,采用三种发育反射(翻正反射、趋地反射和悬崖逃避反射)对小鼠进行短期神经功能评定,每组小鼠观察至规定时间经心脏灌注固定后光镜和TUNEL法观察新生小鼠大脑皮层和海马CA1区病理学改变及细胞凋亡情况,免疫组化法检测大脑皮层和海马CA1区AIF、p-JNK阳性细胞表达的动态变化.
结果：短期神经功能的评定：M组小鼠完成翻正反射(M1)、趋地反射(M2)和悬崖逃避反射(M3 )的时间分别都明显长于正常组(N)和假手术组(S)(P<0.01). MKO组完成上述反射的时间均长于MWT组(P<0.01,P<0.01,P<0.05)，各组差异有统计学意义。2.光镜下脑组织病理学改变：(1)HE染色：S组脑组织无水肿、坏死，大脑皮层和海马CA1区神经细胞排列整齐，边界清，形态正常；M组缺血侧大脑皮层及海马CA1区水肿，胞浆胞核空泡化，细胞核固缩，神经细胞数减少，以Mld组最明显，M3d组和M7d组有所减轻，与S组比较显著差异；MWT组脑组织损伤明显减轻，核固缩细胞减少。(2)尼氏染色：S组脑组织尼氏小体结构清晰，排列整齐，呈深蓝色斑块状，分布量多。M组缺血侧人脑皮层及海马CA1区尼氏小体大量丢失，排列稀疏，甚至尼氏小体出现溶解、空泡变性，Mld组最明显。而MWT组相对MKO组，损伤明显减轻，尼氏小体数量较多。3.TUNEL法检测神经细胞凋亡结果：M组缺血侧大脑皮层和海马CA1区TUNEL阳性细胞表达均于HIBD后1d达高峰，之后逐渐下降，各时间点均明显高于S组(P<0.01).MWT组在1 d, 3d, 7d各时间点TUNEL阳性细胞表达较MKO组明显降低(P<0.01).4.免疫组化检测结果：(1)AIF阳性细胞表达结果：正常大脑皮层和海马CA1区AIF阳性细胞少量表达，HIBD后1d达高峰，之后逐渐下降，各时间点AIF阳性细胞表达较S组明显升高(P<0.01).MWT组缺血侧大脑皮层在1d,3d,7d时间点AIF阳性细胞表达较MKO组明显降低(P<0.01,P<0.01,P<0.05)；MWT组缺血侧海马CA1区在1d, 3d,7d时间点AIF阳性细胞表达较MKO组明显降低(P<0.01,P<0.05,P<0.05).(2) P-JNK阳性细胞表达结果：正常大脑皮层和海马CA1区P-JNK蛋白极少量表达，HIBD后1d达高峰，之后逐渐下降，各时间点P-JNK阳性细胞表达较S组明显升高(P<0.01)。大脑皮层和海马CA1区MWT组1d,3d,7d时间点P-JNK阳性细胞表达较MKO组明显降低E(P<0.01,P<0.05,P>0.05).5.直线相关性分析：(1)KO组、WT组大脑皮层的神经细胞凋亡表达与P-JNK表达的平均吸光度值呈显著正相关(r=x.850,P<0.01).(2)KO组、WT组海马CA1区的神经细胞凋亡表达与P-JNK表达的平均吸光度值呈显著正相关(r=0.837,P<0.01).
结论：1.动物的神经行为学、组织病理学及TUNEL法检测神经细胞凋亡，表明成功制作了新生小鼠HIBD模型。2.腺昔Azn受体下调了缺氧缺血性脑损伤AIF和P-JNK的表达，减少了神经细胞的凋亡，从而拮抗缺氧缺血性脑损伤。3. AIF和P-JNK的动态表达变化及与神经细胞凋亡的相关性分析，提示腺昔Azn受体在缺氧缺血性脑损伤过程中的保护机制可能与抑制P-JNK的持续激活有关。