腹泻仔猪肠道病毒群落分析及变异PEDV的分离和鉴定

来源 :上海市畜牧兽医学会2013年学术年会 | 被引量 : 0次 | 上传用户:abcdef13333
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  发掘和鉴定新发病毒是预防、诊断和治疗新发病毒性传染病的首要任务.传统的诊断技术在挖掘新发病毒的研究中存在很多局限和不足.病毒宏基因组学是在宏基因组学的基础上演化而来的一门研究特定环境中的新兴技术,能充分挖掘特定环境中的病毒群落,并且已经被广泛应用.2010年以来,在我国出现的高发病率和高死亡率的仔猪腹泻病给我国的养猪业带来巨大的经济损失.国内多家科研院所认为此次腹泻的病原可能是猪博卡病毒、轮状病毒、PEDV、猪传染性胃肠炎和Kobuvirus等.到底是何种因素引起的此次仔猪腹泻?单一病原,多种病因,还是新发病原?本研究应用病毒宏基因组学技术,通过处理样品、去除病毒颗粒外的核酸物质、随机引物合成双链cDNA、PCR扩增病毒遗传物质、构建高通量测序文库、高通量测序和生物信息学等分析20份5-7日龄腹泻仔猪肠道病毒群落和9份健康对照的结果显示:在腹泻组中发掘的病毒及阳性率为变异PEDV (17/20)、Kobuvirus (12/20)、双链RNA病毒(1/20)、轮状病毒(1/20)、和肠道病毒(1/20),在健康对照组中发掘的病毒及阳性率为:变异PEDV (1/9)、Kobuvirus(6/9)、双链RNA病毒(1/9)和轮状病毒(1/9).由此可见,变异PEDV在此次仔猪腹泻中扮演者重要的角色.鉴于变异PEDV可能为此次仔猪腹泻的主要病因,本研究针对变异PEDV的流行株进行病毒的分离及鉴定.参照相关参考文献,用含有不同浓度胰酶的DMEM培养基作为维持液培养接毒的Vero细胞.经过3-8代盲传后,细胞出现明显的细胞病变.通过RT-PCR和免疫荧光检测,结果显示成功分离到PEDV,暂命名为JS-2013.为验证该分离株JS-2013为流行的变异PEDV,我们对JS-2013进行全基因组克隆.结果显示该分离株的基因组大小为28038bp(不含PolyA),其S基因和SM98、LZC、CV777和DR13的核苷酸同源性分别为93%、93%、94%和95%,和近2年提交至GenBank的国内流行株的同源性为98-100%,该分离株的其它基因和SM98、LZC、CV777和DR13的同源性分别为96-98%,和近2年在国内流行的PEDV的同源性为98-100%.该病毒的病变表现为细胞变圆、变大、细胞融合及大量脱落.病毒的细胞感染滴度测定结果显示JS-2013的TCID50大于107.5/mL,其可作为研发疫苗的候选分离株.总结,本研究应用病毒宏基因组学技术结合高通量测序和生物信息学分析我国腹泻仔猪粪便内的病毒群落,初步鉴定出此次腹泻的主要病因为变异PEDV;分离和鉴定1株变异PEDV(JS-2013),其可作为研发疫苗的候选毒株.
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